Revers-genetische Charakterisierung des subgenomischen Promotors des Maus-Norovirus

Abstract

Das Norovirus gilt nach aktuellen epidemiologischen Studien als der wichtigste Erreger akuter viraler Gastroenteritiden weltweit. In der Norovirus-Forschung ist es schwierig, neue Informationen über den Lebenszyklus und die Pathogenese zu erhalten, da humane Noroviren nicht in-vitro replizieren. Das murine Norovirus (MNV) wurde 2003 entdeckt und gilt wegen seiner genetischen Ähnlichkeit und dem vorhandenen Zellkultursystem als experimenetelles Surrogat für humane Noroviren. <br /> In dieser Arbeit wurde ein leicht zu handhabendes und effizientes reverses Genetiksystem für MNV entwickelt. Das Verfahren basiert auf einem T7 RNA-Polymerase-Promotor-System für die in-vitro Transkription von gecappter, infektiöser RNA, welche über die Transfektion in BHK-J Zellen zu einer effizienten Ausbeute an rekombinanten MNV führt. Durch die Verwendung eines PCR-Produktes als Template für die in-vitro Transkription unterscheidet sich dieses reverse Genetiksystem von allen bisher für MNV publizierten Methoden. Neben der Zeitersparnis bietet das Verfahren den Vorteil, dass auf die Unterstützung eines Helfervirus verzichtet werden kann. <br /> Dieses reverse Genetiksystem diente als Basis einer Mutagenesestudie des subgenomischen Promotors. Bei Caliciviren besteht der Promotor aus einer Stem-Loop Struktur, welche sich kurz vor ORF2 befindet. Ein systematisches Scanning dieses Sequenzabschnittes durch Einfach- und Doppel-mutanten erfolgte. Die Analyse der letalen Punktmutationen im Stem-Loop zeigte, dass jegliche strukturelle Veränderung sich nachteilig auf die Virus-Replikation auswirkt. Zweifachmutanten bestätigten dieses Ergebnis, da in korrespondierenden Strukturelementen replizierende Doppel-mutanten dann erhalten werden konnten, wenn die Mutationen eine in der Einzelmutante verloren gegangene Basenpaarung wiederherstellten. Ein Scanning des angrenzenden 5‘-Genomabschnittes zeigte keine tolerierte Mutation, bei einer vor dem Promotor liegenden Sequenz von fast 1000 Nukleotiden. Eine genaue Bestimmung des subgenomische Promotors in 5‘-Richtung war nicht möglich, da die mutagenisierten Sequenzelemente wahrscheinlich noch andere essentielle Funktionen übernehmen. <br /> Nichtreplizierende Promotormutanten zeigten weder auf der Transkriptions- noch auf der Translationsebene Aktivität im Northern- oder Western Blot. Mutanten, die keine subgenomische RNA produzieren, exprimieren auch keine Nichtstrukturproteine. Demnach kontrolliert der subgenomische Promotor nicht nur die subgenomische RNA-Synthese, sondern auch die vollständige Virus-Replikation. <br /> Durch Trennung von ORF1 und ORF2 und Insertion von 17 zusätzlichen Nukleotiden an dieser Position resultierte kein nachteiliger Effekt auf die Replikation. In Zukunft könnte deshalb die Insertion einer exogenen Sequenz eine Möglichkeit zur Herstellung eines Norovirus-Reportervirus liefern.