Medizinische Chemie und molekulare Pharmakologie G-Protein-gekoppelter Purin- und verwandter Waisen-Rezeptoren
Medizinische Chemie und molekulare Pharmakologie G-Protein-gekoppelter Purin- und verwandter Waisen-Rezeptoren
View/Type of Scholarly Publication
DissertationDate of Exam
11.04.2014Date of Publication
17.06.2014Advisor
Müller, Christa E.Co-Referee
Schiedel, Anke C.Metadata
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Abstract
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren gehören zu den wichtigsten pharmakologischen Zielstrukturen. Für einige dieser Rezeptoren wurden purinerge Verbindungen (Adenin-Nucleotide, Adenosin und Adenin) als endogene Agonisten beschrieben. Neben G-Protein-gekoppelten Purin-Rezeptoren befasst sich die vorliegende Arbeit auch mit verwandten Rezeptoren, deren endogener Agonist unbekannt ist - sogenannten Waisenrezeptoren.
Adenin-Rezeptoren (AdeR) stellen eine neue und wenig erforschte Klasse G-Protein-gekoppelter Rezeptoren dar. Drei Vertreter dieser Rezeptorklasse waren bekannt: ein Rezeptor der Ratte (rAdeR) und zwei Rezeptoren der Maus (mAde1R und mAde2R). Ein neuer Adenin-Rezeptor des Chinesischen Streifenhamsters konnte identifiziert und charakterisiert werden, der cAdeR genannt wurde (c steht für die Spezies Cricetulus griseus): Nach der Identifikation der cDNA des cAdeR erfolgte die Expression des Rezeptors in Sf9-Insektenzellen. Mit Membranpräparationen dieser Zellen konnten Radioligand-Bindungsstudien durchgeführt werden. Es wurde gezeigt, dass diese Adenin mit hoher Affinität und Kapazität binden (KD 301 nM, Bmax 17.7 pmol/mg Protein) und dass der cAdeR die meisten Veränderungen des Adenin-Moleküls nicht oder nicht gut toleriert. Mit Hilfe eines retroviralen Expressionssystems wurde der cAdeR in CHO-Zellen zur Expression gebracht. In funktionellen Experimenten mit diesen Zellen konnte gezeigt werden, dass der Rezeptor durch Adenin aktiviert wird und genau wie die AdeR der Ratte und der Maus Gi-gekoppelt ist (EC50 51.6 nM). Darüber hinaus weist der Rezeptor eine zusätzliche Gq-Kopplung auf (EC50 128 nM).
Weiterhin wurde der P2Y-Rezeptor-artige Waisenrezeptor GPR35 untersucht. Bislang gibt es nur wenige Hinweise auf die (patho)physiologische Rolle des Rezeptors, auch weil keine geeigneten hochpotenten und selektiven Agonisten für diesen Rezeptor zur Verfügung stehen. Unter Einsatz von β-Arrestin-Rekrutierungs-Experimenten konnten neue Leitstrukturen für GPR35-Agonisten identifiziert werden. 8-Nitro-4-oxo-4H-chromen-2-carbonsäure wurde als niedermolekularer Agonist mit moderater Wirksamkeit für die weitere Optimierung ausgewählt. Durch die sorgfältige Analyse der Struktur-Wirkungs-Beziehungen wurden Agonisten entwickelt, deren Wirksamkeit sukzessive gesteigert werden konnte: Die Verbindung 6-Brom-8-(4-methoxybenzamido)-4-oxo-4H-chromen-2-carbonsäure (PSB-13253) stellte den zum Zeitpunkt ihrer Entwicklung potentesten Agonisten am humanen GPR35 dar (EC50 12.1 nM in β-Arrestin-Rekrutierungs-Experimenten). Zudem konnte eine >1700fache Selektivität für den hGPR35 gegenüber dem eng verwandten hGPR55 nachgewiesen werden.
PSB-13253 wurde durch Tritiierung radioaktiv markiert. Es konnte gezeigt werden, dass der neue Radioligand [3H]PSB-13253 mit hoher Affinität (KD 5.27 nM, Bmax 12.6 pmol/mg Protein) an den hGPR35 bindet. Damit war es nun erstmals möglich, die Affinität von GPR35-Liganden in Radioligand-Bindungsstudien zu bestimmen. Neben Standard-Agonisten wurden auch alle zuvor nur funktionell untersuchten Chromenon-Derivate in Bindungsstudien getestet. Basierend auf diesen Testergebnissen wurden neue Fluor-substituierte PSB-13253-Derivate entwickelt. Diese gehören zu den potentesten GPR35-Agonisten die bislang bekannt sind. 6-Brom-8-(2,6-difluor-4-methoxybenzamid)-4-oxo-4H-chromen-2-carbonsäure (Verbindung 314) weist mit einem Ki-Wert im subnanomolaren Bereich (Ki 589 nM) die höchste Affinität unter allen getesteten GPR35-Liganden auf. Ausgehend von der ersten Leitstruktur bis hin zu dieser Verbindung konnten Wirksamkeit und Affinität um mehr als den Faktor 8000 gesteigert werden. Sowohl Verbindung 314 als auch der neue Radioligand stellen wertvolle pharmakologische Werkzeuge zur weiteren Erforschung des Waisen-Rezeptors GPR35, insbesondere seiner (patho)physiologischen Rolle, dar.
Adenin-Rezeptoren (AdeR) stellen eine neue und wenig erforschte Klasse G-Protein-gekoppelter Rezeptoren dar. Drei Vertreter dieser Rezeptorklasse waren bekannt: ein Rezeptor der Ratte (rAdeR) und zwei Rezeptoren der Maus (mAde1R und mAde2R). Ein neuer Adenin-Rezeptor des Chinesischen Streifenhamsters konnte identifiziert und charakterisiert werden, der cAdeR genannt wurde (c steht für die Spezies Cricetulus griseus): Nach der Identifikation der cDNA des cAdeR erfolgte die Expression des Rezeptors in Sf9-Insektenzellen. Mit Membranpräparationen dieser Zellen konnten Radioligand-Bindungsstudien durchgeführt werden. Es wurde gezeigt, dass diese Adenin mit hoher Affinität und Kapazität binden (KD 301 nM, Bmax 17.7 pmol/mg Protein) und dass der cAdeR die meisten Veränderungen des Adenin-Moleküls nicht oder nicht gut toleriert. Mit Hilfe eines retroviralen Expressionssystems wurde der cAdeR in CHO-Zellen zur Expression gebracht. In funktionellen Experimenten mit diesen Zellen konnte gezeigt werden, dass der Rezeptor durch Adenin aktiviert wird und genau wie die AdeR der Ratte und der Maus Gi-gekoppelt ist (EC50 51.6 nM). Darüber hinaus weist der Rezeptor eine zusätzliche Gq-Kopplung auf (EC50 128 nM).
Weiterhin wurde der P2Y-Rezeptor-artige Waisenrezeptor GPR35 untersucht. Bislang gibt es nur wenige Hinweise auf die (patho)physiologische Rolle des Rezeptors, auch weil keine geeigneten hochpotenten und selektiven Agonisten für diesen Rezeptor zur Verfügung stehen. Unter Einsatz von β-Arrestin-Rekrutierungs-Experimenten konnten neue Leitstrukturen für GPR35-Agonisten identifiziert werden. 8-Nitro-4-oxo-4H-chromen-2-carbonsäure wurde als niedermolekularer Agonist mit moderater Wirksamkeit für die weitere Optimierung ausgewählt. Durch die sorgfältige Analyse der Struktur-Wirkungs-Beziehungen wurden Agonisten entwickelt, deren Wirksamkeit sukzessive gesteigert werden konnte: Die Verbindung 6-Brom-8-(4-methoxybenzamido)-4-oxo-4H-chromen-2-carbonsäure (PSB-13253) stellte den zum Zeitpunkt ihrer Entwicklung potentesten Agonisten am humanen GPR35 dar (EC50 12.1 nM in β-Arrestin-Rekrutierungs-Experimenten). Zudem konnte eine >1700fache Selektivität für den hGPR35 gegenüber dem eng verwandten hGPR55 nachgewiesen werden.
PSB-13253 wurde durch Tritiierung radioaktiv markiert. Es konnte gezeigt werden, dass der neue Radioligand [3H]PSB-13253 mit hoher Affinität (KD 5.27 nM, Bmax 12.6 pmol/mg Protein) an den hGPR35 bindet. Damit war es nun erstmals möglich, die Affinität von GPR35-Liganden in Radioligand-Bindungsstudien zu bestimmen. Neben Standard-Agonisten wurden auch alle zuvor nur funktionell untersuchten Chromenon-Derivate in Bindungsstudien getestet. Basierend auf diesen Testergebnissen wurden neue Fluor-substituierte PSB-13253-Derivate entwickelt. Diese gehören zu den potentesten GPR35-Agonisten die bislang bekannt sind. 6-Brom-8-(2,6-difluor-4-methoxybenzamid)-4-oxo-4H-chromen-2-carbonsäure (Verbindung 314) weist mit einem Ki-Wert im subnanomolaren Bereich (Ki 589 nM) die höchste Affinität unter allen getesteten GPR35-Liganden auf. Ausgehend von der ersten Leitstruktur bis hin zu dieser Verbindung konnten Wirksamkeit und Affinität um mehr als den Faktor 8000 gesteigert werden. Sowohl Verbindung 314 als auch der neue Radioligand stellen wertvolle pharmakologische Werkzeuge zur weiteren Erforschung des Waisen-Rezeptors GPR35, insbesondere seiner (patho)physiologischen Rolle, dar.
Subjects
GPCR, GPR35, Waisenrezeptor, Radioligand, Adenin-Rezeptor, AdeR, orphan receptor, adenine receptor
Classification (DDC)
500 NaturwissenschaftenThimm, Dominik Tobias: Medizinische Chemie und molekulare Pharmakologie G-Protein-gekoppelter Purin- und verwandter Waisen-Rezeptoren. - Bonn, 2014. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5n-36389
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5n-36389
@phdthesis{handle:20.500.11811/6105,
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author = {{Dominik Tobias Thimm}},
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year = 2014,
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Adenin-Rezeptoren (AdeR) stellen eine neue und wenig erforschte Klasse G-Protein-gekoppelter Rezeptoren dar. Drei Vertreter dieser Rezeptorklasse waren bekannt: ein Rezeptor der Ratte (rAdeR) und zwei Rezeptoren der Maus (mAde1R und mAde2R). Ein neuer Adenin-Rezeptor des Chinesischen Streifenhamsters konnte identifiziert und charakterisiert werden, der cAdeR genannt wurde (c steht für die Spezies Cricetulus griseus): Nach der Identifikation der cDNA des cAdeR erfolgte die Expression des Rezeptors in Sf9-Insektenzellen. Mit Membranpräparationen dieser Zellen konnten Radioligand-Bindungsstudien durchgeführt werden. Es wurde gezeigt, dass diese Adenin mit hoher Affinität und Kapazität binden (KD 301 nM, Bmax 17.7 pmol/mg Protein) und dass der cAdeR die meisten Veränderungen des Adenin-Moleküls nicht oder nicht gut toleriert. Mit Hilfe eines retroviralen Expressionssystems wurde der cAdeR in CHO-Zellen zur Expression gebracht. In funktionellen Experimenten mit diesen Zellen konnte gezeigt werden, dass der Rezeptor durch Adenin aktiviert wird und genau wie die AdeR der Ratte und der Maus Gi-gekoppelt ist (EC50 51.6 nM). Darüber hinaus weist der Rezeptor eine zusätzliche Gq-Kopplung auf (EC50 128 nM).
Weiterhin wurde der P2Y-Rezeptor-artige Waisenrezeptor GPR35 untersucht. Bislang gibt es nur wenige Hinweise auf die (patho)physiologische Rolle des Rezeptors, auch weil keine geeigneten hochpotenten und selektiven Agonisten für diesen Rezeptor zur Verfügung stehen. Unter Einsatz von β-Arrestin-Rekrutierungs-Experimenten konnten neue Leitstrukturen für GPR35-Agonisten identifiziert werden. 8-Nitro-4-oxo-4H-chromen-2-carbonsäure wurde als niedermolekularer Agonist mit moderater Wirksamkeit für die weitere Optimierung ausgewählt. Durch die sorgfältige Analyse der Struktur-Wirkungs-Beziehungen wurden Agonisten entwickelt, deren Wirksamkeit sukzessive gesteigert werden konnte: Die Verbindung 6-Brom-8-(4-methoxybenzamido)-4-oxo-4H-chromen-2-carbonsäure (PSB-13253) stellte den zum Zeitpunkt ihrer Entwicklung potentesten Agonisten am humanen GPR35 dar (EC50 12.1 nM in β-Arrestin-Rekrutierungs-Experimenten). Zudem konnte eine >1700fache Selektivität für den hGPR35 gegenüber dem eng verwandten hGPR55 nachgewiesen werden.
PSB-13253 wurde durch Tritiierung radioaktiv markiert. Es konnte gezeigt werden, dass der neue Radioligand [3H]PSB-13253 mit hoher Affinität (KD 5.27 nM, Bmax 12.6 pmol/mg Protein) an den hGPR35 bindet. Damit war es nun erstmals möglich, die Affinität von GPR35-Liganden in Radioligand-Bindungsstudien zu bestimmen. Neben Standard-Agonisten wurden auch alle zuvor nur funktionell untersuchten Chromenon-Derivate in Bindungsstudien getestet. Basierend auf diesen Testergebnissen wurden neue Fluor-substituierte PSB-13253-Derivate entwickelt. Diese gehören zu den potentesten GPR35-Agonisten die bislang bekannt sind. 6-Brom-8-(2,6-difluor-4-methoxybenzamid)-4-oxo-4H-chromen-2-carbonsäure (Verbindung 314) weist mit einem Ki-Wert im subnanomolaren Bereich (Ki 589 nM) die höchste Affinität unter allen getesteten GPR35-Liganden auf. Ausgehend von der ersten Leitstruktur bis hin zu dieser Verbindung konnten Wirksamkeit und Affinität um mehr als den Faktor 8000 gesteigert werden. Sowohl Verbindung 314 als auch der neue Radioligand stellen wertvolle pharmakologische Werkzeuge zur weiteren Erforschung des Waisen-Rezeptors GPR35, insbesondere seiner (patho)physiologischen Rolle, dar.},
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note = {G-Protein-gekoppelte Rezeptoren gehören zu den wichtigsten pharmakologischen Zielstrukturen. Für einige dieser Rezeptoren wurden purinerge Verbindungen (Adenin-Nucleotide, Adenosin und Adenin) als endogene Agonisten beschrieben. Neben G-Protein-gekoppelten Purin-Rezeptoren befasst sich die vorliegende Arbeit auch mit verwandten Rezeptoren, deren endogener Agonist unbekannt ist - sogenannten Waisenrezeptoren.
Adenin-Rezeptoren (AdeR) stellen eine neue und wenig erforschte Klasse G-Protein-gekoppelter Rezeptoren dar. Drei Vertreter dieser Rezeptorklasse waren bekannt: ein Rezeptor der Ratte (rAdeR) und zwei Rezeptoren der Maus (mAde1R und mAde2R). Ein neuer Adenin-Rezeptor des Chinesischen Streifenhamsters konnte identifiziert und charakterisiert werden, der cAdeR genannt wurde (c steht für die Spezies Cricetulus griseus): Nach der Identifikation der cDNA des cAdeR erfolgte die Expression des Rezeptors in Sf9-Insektenzellen. Mit Membranpräparationen dieser Zellen konnten Radioligand-Bindungsstudien durchgeführt werden. Es wurde gezeigt, dass diese Adenin mit hoher Affinität und Kapazität binden (KD 301 nM, Bmax 17.7 pmol/mg Protein) und dass der cAdeR die meisten Veränderungen des Adenin-Moleküls nicht oder nicht gut toleriert. Mit Hilfe eines retroviralen Expressionssystems wurde der cAdeR in CHO-Zellen zur Expression gebracht. In funktionellen Experimenten mit diesen Zellen konnte gezeigt werden, dass der Rezeptor durch Adenin aktiviert wird und genau wie die AdeR der Ratte und der Maus Gi-gekoppelt ist (EC50 51.6 nM). Darüber hinaus weist der Rezeptor eine zusätzliche Gq-Kopplung auf (EC50 128 nM).
Weiterhin wurde der P2Y-Rezeptor-artige Waisenrezeptor GPR35 untersucht. Bislang gibt es nur wenige Hinweise auf die (patho)physiologische Rolle des Rezeptors, auch weil keine geeigneten hochpotenten und selektiven Agonisten für diesen Rezeptor zur Verfügung stehen. Unter Einsatz von β-Arrestin-Rekrutierungs-Experimenten konnten neue Leitstrukturen für GPR35-Agonisten identifiziert werden. 8-Nitro-4-oxo-4H-chromen-2-carbonsäure wurde als niedermolekularer Agonist mit moderater Wirksamkeit für die weitere Optimierung ausgewählt. Durch die sorgfältige Analyse der Struktur-Wirkungs-Beziehungen wurden Agonisten entwickelt, deren Wirksamkeit sukzessive gesteigert werden konnte: Die Verbindung 6-Brom-8-(4-methoxybenzamido)-4-oxo-4H-chromen-2-carbonsäure (PSB-13253) stellte den zum Zeitpunkt ihrer Entwicklung potentesten Agonisten am humanen GPR35 dar (EC50 12.1 nM in β-Arrestin-Rekrutierungs-Experimenten). Zudem konnte eine >1700fache Selektivität für den hGPR35 gegenüber dem eng verwandten hGPR55 nachgewiesen werden.
PSB-13253 wurde durch Tritiierung radioaktiv markiert. Es konnte gezeigt werden, dass der neue Radioligand [3H]PSB-13253 mit hoher Affinität (KD 5.27 nM, Bmax 12.6 pmol/mg Protein) an den hGPR35 bindet. Damit war es nun erstmals möglich, die Affinität von GPR35-Liganden in Radioligand-Bindungsstudien zu bestimmen. Neben Standard-Agonisten wurden auch alle zuvor nur funktionell untersuchten Chromenon-Derivate in Bindungsstudien getestet. Basierend auf diesen Testergebnissen wurden neue Fluor-substituierte PSB-13253-Derivate entwickelt. Diese gehören zu den potentesten GPR35-Agonisten die bislang bekannt sind. 6-Brom-8-(2,6-difluor-4-methoxybenzamid)-4-oxo-4H-chromen-2-carbonsäure (Verbindung 314) weist mit einem Ki-Wert im subnanomolaren Bereich (Ki 589 nM) die höchste Affinität unter allen getesteten GPR35-Liganden auf. Ausgehend von der ersten Leitstruktur bis hin zu dieser Verbindung konnten Wirksamkeit und Affinität um mehr als den Faktor 8000 gesteigert werden. Sowohl Verbindung 314 als auch der neue Radioligand stellen wertvolle pharmakologische Werkzeuge zur weiteren Erforschung des Waisen-Rezeptors GPR35, insbesondere seiner (patho)physiologischen Rolle, dar.},
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