Enzymatische und Chemische Studien zu trans-AT-Polyketidsynthasen

Abstract

Die vorliegende Dissertation befasst sich mit der Untersuchung von trans-Acyltransferase-Polyketidsynthase (trans-AT-PKS)-Systemen. Diese noch relativ wenig erforschte Klasse von Polyketidsynthasen (PKS) zeichnet sich durch die in trans agierenden AT aus und wird somit von den cis-AT-PKS unterschieden, deren AT in den Multienzymkomplex integriert sind. Sowohl die hohe Diversität als auch die häufig vorhandene Bioaktivität der Metabolite dieser PKS-Klasse macht sie besonders interessant in Hinblick auf mögliche Anwendungen in der Pharmaindustrie. Viele dieser Naturstoffe könnten jedoch eine höhere Wirksamkeit z.B. gegen Krebs entfalten, wenn Modifikationen an ihnen vorgenommen werden würden. Das ist Aufgabe der kombinatorischen Biosynthese. Dabei wird gezielt in die Domänenarchitektur der PKS eingegriffen um den Naturstoff umzustrukturieren. Bei diesen Eingriffen sind jedoch Regeln zu beachten, damit die Biosynthese auch weiterhin reibungslos funktioniert. Diese Regeln sind aber nicht vollständig bekannt und viele Fragestellungen dazu offen. Im Rahmen dieser Arbeit sollten neue Erkenntnisse über diese bisher sehr wenig erforschte Klasse von Enzymen und über ihre Produkte gewonnen werden. Der Kenntnisstand bezüglich einer möglichen biotechnologischen Anwendung dieser Enzyme ist entsprechend des Forschungsstands ebenfalls gering. Die Arbeit sollte auch dazu beitragen das Verständnis in dieser Hinsicht zu erweitern. Dabei wurde in zwei unabhängigen Projekten mit unterschiedlichen trans-AT-PKS-Systemen gearbeitet. <br /> Das trans-AT-PKS-System mit dem im ersten Projekt gearbeitet worden ist, ähnelte regionsweise dem Gencluster des Pederins und anderer pederinartiger Metabolite. Die Pederinfamilie ist eine Gruppe von Naturstoffen, die ein Strukturfragment teilt, das unter anderem ein Pyransystem und eine Enamidgruppe mit einschließt. Interessant ist diese Gruppe vor allem, weil ihre Mitglieder stets in symbiotischen Assoziationen zumeist von bislang unbekannten Mikroorganismen produziert werden und dem Wirt in ihrer oftmals toxischen Wirkung zum Vorteil gegenüber Fressfeinden verhelfen. Alle PKS dieser Gruppe gehören den trans-AT-PKS an und lassen sich erstaunlicherweise in sehr diversen Organismen und Lebensräumen wiederfinden. Dies unterstützt die Hypothese eines horizontalen Gentransfers von Genen des Pederintyps. Der erst kürzlich durch die Arbeitsgruppe von Prof. Ólafur Andrésson der Universität Reykjavik in Island entdeckte, der Pederinfamilie angehörende Gencluster wurde aus dem Metagenom der Flechte Peltigera membranacea isoliert und sequenziert. Die Sequenz wurde von Prof. Jörn Piel für eine Vorhersage der Struktur des Produkts genutzt. Auf Basis dieser Vorhersage war es Ziel dieser Arbeit, die Substanz zu detektieren, zu isolieren und mittels einer kompletten Strukturanalyse die Übereinstimmung von realer Struktur und Vorhersage zu überprüfen. Von der Aufklärung der Korrelation zwischen Domänenabfolge und Struktur wurden neue Erkenntnisse über die Funktionsweise von trans-AT-PKS erhofft. Auch Fragestellungen die Evolution der Gencluster der Pederinfamilie und die ökologische Rolle ihrer Metabolite betreffend, sollten geklärt werden. Der pederinartige Naturstoff, dessen Sequenz bekannt war, sollte zunächst aus der Flechte Peltigera membranacea extrahiert werden. Zu diesem Zwecke wurde getrocknetes Flechtenmaterial mehrfach extrahiert und die erhaltenen Rohextrakte chromatographisch aufgereinigt. Die einzelnen Fraktionen wurden mittels massenspektrometrischer Untersuchungen, Dünnschichtchromatographie und Cytotoxitätstest nach der durch den Gencluster kodierten Substanz durchsucht. Da diese Suche ohne Erfolg blieb, wurde eine Kultur des mit dem Mykobionten symbiotisch lebenden und den Gencluster tragenden Cyanobakteriums Nostoc N6 im großen Maßstab angelegt. Der Kultur wurde 13C-markiertes Hydrogencarbonat hinzugefüttert. Mit der Kombination der 13C-Isotopenmarkierung und der Verwendung von LC-SPE-NMR (liquid chromatography–solid phase extraction–nuclear magnetic resonance) konnten trotz geringster Mengen des Substrats neben den 1H- und 13C-Spektren auch die 2D-Spektren H, H-Cosy, HMBC und HSQC aufgenommen werden. Die Datenanalyse führte zur vollständigen Strukturaufklärung der Substanz, die fortan Nosperin genannt wurde. Dieses erweitert nicht nur die Liste bekannter pederinartiger trans-AT-PKS-Metabolite, sondern auch die biosynthetischer Enzyme der trans-AT-PKS. Zudem ist eine weitere Symbiose bekannt, die Rückschlüsse auf die ökologische Rolle pederinartiger Metabolite zulässt. Die Evolution dieser Gencluster kann auch näher beleuchtet werden, da der symbiontische Partner in diesem Falle bekannt ist und dieses Wissen zukünftig genutzt werden kann, um die verwandtschaftlichen Verhältnisse und den horizontalen Gentransfer nachzuverfolgen.<br /> Im zweiten Projekt wurde für die Studien an trans-AT-PKS-Systemen der bae-Gencluster verwendet. Dieser kodiert für das in Bacillus amyloliquefaciens FZB42 produzierte Bacillaen, das eine antibiotische Aktivität aufweist. Der Fokus lag auf der Substratspezifität der fünf ersten aktiven Ketosynthasen (KS) der Bacillaen-PKS. KS sind für die Kondensation der Startereinheit und der folgenden Elongationseinheit bzw. der weiteren Elongationseinheiten zuständig. Nguyen et al. zeigten in ihrer Arbeit mittels bioinformatischer Analysen, dass bei KS in trans-AT-PKS-Systemen eine Korrelation zwischen der Verwandtschaft der KS-Domänen und ihrer Funktionsweise besteht. Aus diesen in silico Analysen resultierte die Hypothese, dass die KS eine Substratspezifität zeigt, die auf bestimmte Positionen im Substratintermediat beschränkt ist, d.h. dass eine Molekülregion der Substrate über deren Akzeptanz entscheidet. Diese bislang nur theoretische Annahme sollte an den bae-KS experimentell bestätigt werden. Umgesetzt werden sollte dies mittels zweier alternativer Ansätze. Die erste Variante verfolgte einen mutasynthetischen Ansatz, bei dem synthetische N-Acetylcysteamin (SNAC)-Thioesterderivate in vivo der dafür eigens klonierten Deletionsmutante AK2 hinzugefüttert worden sind. Dabei wurde das Initiationsmodul der Bacillaen-PKS in Bacillus amyloliquefaciens FZB42 mittels homologer Rekombination deletiert. Dies hatte zur Folge, dass die Bacillaensynthese nicht initiiert werden konnte und die Mutante somit nicht in der Lage ist, die Substanz zu produzieren. Der hinzugefütterte SNAC-Thioester, der dem natürlichen Intermediat der KS2 entsprach, hätte theoretisch von dieser akzeptiert werden und die Bacillaenbiosynthese damit wieder stattfinden müssen. Die Resultate sprachen jedoch dafür, dass die Mutante die SNAC-Thioester nicht aufnehmen und somit auch nicht weiter verstoffwechseln konnte. Um dieses Problem zu umgehen, wurden die SNAC-Thioester direkt den KS in vitro hinzugefüttert und mittels ESI-MS (Elektronenspray-Ionisation-Massenspektrometrie) festgestellt, ob eine Acylierung der KS stattfand und in welcher Zeit das dargereichte Substrat umgesetzt wurde. Die Ergebnisse dieser Messungen bestätigten die bereits erwähnte Hypothese, dass bestimmte Positionen des Substrats oder spezifischer - die β-Position ausgehend von der Carbonylfunktion des neukondensierten Teils des Substrats eine tragende Rolle für die Substraterkennung spielt. Vor allem der sterische Anspruch der in dieser Position befindlichen Gruppen entschied über die Akzeptanz des Substrats. Dies konnte eindeutig für die KS1, 2 und 5 nachgewiesen werden. Zudem konnte bei der KS1 gezeigt werden, dass das in diesem Fall vorliegende sekundäre Amin wichtige Interaktionen mit dem Substrat eingeht, da eine Abwesenheit dieser Gruppe sich in einer Nichtakzeptanz des Substrats geäußert hat. Diese Ergebnisse sind äußerst relevant für die kombinatorische Biosynthese. Mit dem hier erworbenen Wissen über die Substratspezifitäten der KS, ist es z.B. möglich gezielt KS-Domänen bzw. ganze Module in fremde Gencluster zu integrieren oder diese auch zu eliminieren, da jetzt bekannt ist, welche Substratpositionen entscheidend für die Toleranz und damit für das Fortschreiten der Kettenverlängerung ist. Umgekehrt könnten auch den trans-AT-PKS gezielt synthetische Derivate zugeführt werden. Auf beiden Wegen könnten unnatürliche Produkte mit möglicherweise verbesserter pharmakologischer Wirksamkeit generiert werden.