Chemisch modifizierte Aptamere

Abstract

In der klinischen Diagnostik besteht ein großes Interesse an verlässlichen Systemen zur kostengünstigen Quantifizierung von Biomarkern. Im Falle eines Enzyms als Zielmolekül ist neben der Messung der Menge auch die Bestimmung der katalytischen Aktivität von Belang. Zur Bewältigung dieser Aufgabe können Protein-bindende Oligonukleotide, sogenannte Aptamere, und deren chemische Modifikation beitragen.<br /> Diese Arbeit zeigt, dass die mit Biotin-Gruppen versehenen Aptamere HD1 22 bio und HS02-52G-bio ihre Zielproteine Thrombin und aktiviertes Protein C sogar in Gegenwart von Inhibitoren der jeweiligen Enzymfunktion binden. Dieses Ergebnis trug zur Entwicklung des ersten Testsystems für die direkte, Aptamer-basierte Quantifizierung der katalytischen Aktivität von Thrombin aus Patientenproben bei (OLIGOBIND^®<em>Thrombin activity assay</em>, American Diagnostica).<br /> Um einen sensiblen Sensor zu entwickeln, ist eine möglichst hohe Affinität des bindenden Elements an das Zielmolekül notwendig. Daher wurden im Zuge dieser Dissertation verdrehte interkalierende Nukleinsäuren (<em>Twisted intercalating nucleic acids</em>, TINAs) zur Bindungssteigerung in Oligonukleotide eingebaut. Für die Aptamere HD22 und C10.36 konnten keine effektiven TINA Modifikationen gefunden werden, dafür wurde für C10.36 ein neues Strukturmodell aufgestellt. Das mit TINA-Molekülen chemisch modifizierte HD1 Modul wurde hingegen wirk-sam in das bivalente Aptamer HD1-22 eingebaut und resultierte in der Reduktion der Bindungskonstante von 1,88 ± 0,21 nM auf 0,25 ± 0,02 nM. Die Gerinnungs-zeit verlängerte sich um 37,4 %. Dieses Beispiel verdeutlicht das Baukasten-prinzip multivalenter Aptamere. Wurden die Eigenschaften des Elementes HD1 verbessert, variierte dies auch die Attribute des Gesamtmoleküls HD1-22.<br /> Die Ergebnisse zur Funktionalität des chemisch modifizierten Aptamers in der biologischen Matrix Plasma verdeutlichten die mögliche Applikation nicht nur in der Diagnostik, sondern auch in der molekularbiologischen Forschung. Letztere benötigt ebenfalls kostengünstige Protein-bindende Moleküle zur Inhibition oder Aktivierung biologischer Prozesse. Dieser Vorgang sollte bestenfalls nicht-invasiv sein, um eine Verfälschung der Beobachtung durch das Messsystem auszu-schließen. In dieser Arbeit konnte erfolgreich ein System zur orts- und zeitaufge-lösten Gerinnungsaktivierung etabliert werden. Hierfür wurde HD1, das eine regulatorische Region von Thrombin bindet, mit einer photo-spaltbaren Brücke kovalent mit dem Zielprotein verbunden. Auf diese Weise entstand eine Aptamer-basierte, reversible Epitop Schutzgruppe. Die katalytische Aktivität des Proteins war inhibiert, ließ sich aber durch Bestrahlung mit UV-Licht wieder reaktiveren.<br /> Alle in dieser Arbeit vorgestellten chemischen Modifikationen von Aptameren verdeutlichen ihr Potential als neue Werkzeuge der Chemischen Biologie für Diagnostik und Forschung.