Experimentelle Untersuchung der Lokalisationsröhre von Aktinfilamenten in halbverdünnten Lösungen in Abhängigkeit von der Gegenionkonzentration und der Vororientierung in drei Dimensionen

Abstract

Das Protein Aktin ist ein wichtiger Bestandteil des Zytoskeletts nahezu aller eukaryotischen Zellen. Die Rolle der Aktinfilamente für biologische Prozesse in lebenden Zellen ist von höchster Komplexität. <i>In vitro</i> polymerisiertes Aktin ist ein geeignetes biomimetisches Modellsystem, um unter definierten Versuchsbedingungen diese Mechanismen zu verstehen. Zudem sind Aktinfilamente Vertreter für semiflexible Polymere, deren mechanische und dynamische Eigenschaften maßgeblich durch ihre Biegesteifigkeit bzw. Persistenzlänge bestimmt sind. <br /> Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Dynamik von <i>in vitro</i> polymerisiertem Aktin mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht, wobei der Fokus auf die Fluktuation der Filamente in halbverdünnten Aktinlösungen gelegt wurde. Aufgrund der thermischen Energie fluktuieren die Filamente in einem Raum, welcher durch die Wechselwirkung mit umliegenden Filamenten eingeschränkt ist. Im theoretischen Modell werden diese topologischen Einschränkungen durch das Röhrenmodell berücksichtigt, welches die Wechselwirkungen durch einen röhrenartigen Käfig um die Filamente repräsentiert. In einer vorhergehenden Dissertationsarbeit konnte bereits von Dr. Inka Kirchenbüchler gezeigt werden, dass die Röhrenradien heterogen verteilt sind. Die Verteilungen der Röhrenradien in Abhängigkeit der Konzentration sind zudem in sehr guter Übereinstimmung mit der Segment-Fluid-Theorie, welche in der Arbeitsgruppe von Prof. Kroy (Universität Leipzig) entwickelt wurde. Aus dem Vergleich der Theorie mit den experimentellen Ergebnissen folgte die Vermutung, dass nematische Ordnung einen Einfluss auf die Radien der Lokalisationsröhren haben könnte. Da die Aktinlösungen in Kapillaren untersucht wurden, könnten die Aktinfilamente während der Probenpräparation durch das Befüllen entlang einer Vorzugsrichtung ausgerichtet worden sein. <br /> Daher wurde in dieser Arbeit der Einfluss der Vorgeschichte der Probe, insbesondere durch den Scherfluss, auf die Filamentordnung und Filamentdynamik bestimmt. Zur Untersuchung der Lokalisationsröhre in Abhängigkeit der Ordnung, wurden Mikrokapillaren und makroskopische Kammern verwendet. Dazu wurden die Fluktuationen von fluoreszenzgefärbten Aktinfilamenten in einem unmarkierten Hintergrund an einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop aufgenommen. Um die Ordnung der markierten Filamente in den Probengefäßen quantifizieren zu können, wurde der Ordnungsparameter in drei Dimensionen berechnet. Die Auswertung ergab, dass die Ordnungsparameter in den Kapillaren zu jeder Aktinkonzentration signifikant höher waren als in der Kammer. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass sich der Ordnungsparameter mit zunehmender Segment- wie auch Filamentlänge zu höheren Werten verschiebt. Während in der Kammer die Filamente in Ebenen parallel zur Beobachtungsebene isotrop verteilt waren, waren sie senkrecht zu diesen nur wenig ausgerichtet. Im Vergleich dazu ordneten sich die Filamente in den Kapillaren entlang einer Vorzugsrichtung an, welche durch die Kapillarbefüllung induziert wurde. <br /> Die Kraft, die während der Kapillarbefüllung auf die Filamente wirkte, wurde für zwei Kapillaren unterschiedlicher Größe abgeschätzt. Dazu wurden die Kontaktwinkel, die Oberflächenspannungen von Aktinlösungen und die Füllgeschwindigkeiten in den Kapillaren mit Aktinlösung und Wasser gemessen und anschließend mit diesen Ergebnissen die Scherspannung und Scherrate berechnet. Ein Vergleich dieser Ergebnisse zeigte, dass die Filamente durch die Kapillarbefüllung mit einer Scherrate von bis zu 1400 s^-1 geschert wurden. Das Verhältnis der Scherspannung zu Scherrate definierte eine effektive Viskosität, welche überraschenderweise für Aktinlösungen bei diesen Scherraten mit der Viskosität von Wasser übereinstimmte. <br /> Da somit die gleichen Kräfte in den beiden Kapillaren wirkten, wurden die Filamente gleichermaßen ausgerichtet. Dieses Ergebnis stimmt sehr gut damit überein, dass der berechnete Ordnungsparameter in beiden Kapillaren identisch war. Die Ergebnisse der Lokalisationsröhre in Abhängigkeit des Ordnungsparameters stimmten mit den Annahmen der Onsager-Theorie überein. Die Röhrenradienverteilungen in der makroskopischen Kammer verschoben sich signifikant zu niedrigeren Werten relativ zu den Verteilungen in den Kapillaren. Ein Vergleich der Segment-Fluid-Theorie mit den Experimenten zeigte eine bessere Übereinstimmung für die Werte der Röhrenradien in der makroskopischen Kammer, jedoch waren die Fitparameter immer noch ca. fünfmal kleiner als erwartet. Zudem wurde ein zusätzlicher Fitparameter in der Segment-Fluid-Theorie berücksichtigt, der die Ordnungsparameter aus den experimentell bestimmten Röhrenradienverteilungen vorhersagte und in guter Überstimmung mit den aus den Experimenten berechneten Werten des Ordnungsparameters für die Kapillare ist. <br /> Um die polyelektrische Natur der Aktinfilamente zu berücksichtigen, wurden die Röhrenradien zudem in Abhängigkeit der Gegenionen analysiert. Um die Lokalisationsröhren bei Magnesiumionenkonzentrationen unterhalb des Phasenübergangs von isotrop verteilten zu gebündelten Aktinfilamenten zu messen, wurden mittels Lichtstreumessungen die Konzentrationen des Phasenübergangs bestimmt. Anschließend wurden die Fluktuationen in der makroskopischen Kammer unter physiologischen Pufferbedingungen mit denen bei erhöhter Magnesiumionenkonzentration im Puffer verglichen. Aus diesen Messungen folgte, dass die Aktinfilamente bei erhöhten Magnesiumionenkonzentrationen relativ zum physiologischen Puffer stärker fluktuierten und daher die Lokalisationsröhrenradien signifikant zu höheren Werten verschoben waren. <br /> Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die Lokalisationsröhre sowohl von der Ordnung der Filamente als auch von der Gegenionkonzentration abhängig ist.