Lokaler Gentransfer und Zellpositionierung mittels magnetischer Nanopartikel für die Generierung optogenetischer und biologischer Herzschrittmacher

Abstract

Herzrhythmusstörungen sind Unregelmäßigkeiten der Herzfrequenz, welche für die erkrankten Patienten eine vitale Gefährdung darstellen und sogar tödlich verlaufen können. Ursachen liegen häufig in Störungen des Erregungsbildungs- sowie Weiterleitungssystems und haben oftmals die Implantation eines elektrischen Herzschrittmachers zur Folge. Aufgrund einiger Limitationen der elektrischen Schrittmacher existiert ein fortwährendes Interesse zur Generierung eines alternativen biologischen Ersatzschrittmachers. Jedoch waren die durch Gen- und Zelltherapie generierten Schrittmacher entweder instabil oder nicht mit den Eigenschaften eines nativen Schrittmachers vergleichbar.<br /> Ziel dieser Arbeit war es, mit dem Einsatz von MNPs und angewendeten Magnetfeldern eine räumlich begrenzte Transduktion oder Zellpositionierung innerhalb eines Zellverbunds zu bewirken und dadurch einen lokalen Ersatzschrittmacher zu generieren. Dazu wurde in einem ersten Schritt eine Methode zur Durchführung einer lokalen Transduktion in vitro etabliert, welche sich die physikalischen Eigenschaften von MNPs und eines spezifischen Magnetfeldes mittels speziell konstruierter Magnetspitzen zunutze macht. Die Methode erlaubt bei globaler Applikation der MNP/LV-Komplexe innerhalb von 30 Minuten einen kleinen Zellbereich von 1-2 mm² erfolgreich zu transduzieren. Als Beweis zur Schrittmachergenerierung wurde mit dieser Methode eine lokale Expression von ChR2 auf einem Zellrasen aus HL-1 Kardiomoyzyten erzeugt. Die transduzierten Kardiomyozyten konnten optisch erfolgreich stimuliert werden und als örtlicher Ersatzschrittmacher für den gesamten HL-1 Zellverbund agieren. Für eine Langzeitanalyse von biologischen Schrittmachern auf 2 dimensionaler Ebene wurde eine neue Analysemethode entwickelt, die eine Schrittmacherauswertung jeden Schlages über mehrere Tage erlaubt. Damit konnten Aussagen über Stabilität, Ausprägung und Frequenz der Schrittmacher eingeholt werden. Die Technik diente zur Bewertung der Schrittmacheraktivität des lokal exprimierten, dominant negativen Kir2.1AAA-Kanals, welcher trotz auftretender Instabilität eine signifikant erhöhte Schrittmacheraktivität zeigte. Generell konnte jedoch die Generierung eines biologischen Ersatzschrittmachers durch lokale Expression einzelner Schrittmachergene, wie die HCN-Kanäle oder Kir2.1AAA-Kanal, nicht in stabiler Form etabliert werden. In diesem Zusammenhang wurde auch ein Einfluss der MNPs aufgedeckt. Entsprechend der eingesetzten Eisenmenge wurden entweder Zelltoxizität oder Beeinträchtigungen der elektrophysiologischen Zell-eigenschaften beobachtet.<br /> Der Einsatz von MNPs und Magneten wurde zudem erfolgreich zur Zellpositionierung verwendet. So wurden mit MNP-beladene und ChR2-exprimierende Kardiomyozyten auf einen HL-1 Zellrasen lokalisiert und konnten unter Lichtstimulation Schrittmacheraktivität über den gesamten HL-1 Zellverbund übernehmen.<br /> Zusammenfassend zeigten die optischen Schrittmacher in dieser Arbeit die stabileren Ergebnisse bezüglich einer generierten Schrittmacheraktivität, jedoch muss eine Funktionalität in Langzeitversuchen noch bewiesen werden.<br /> Generell ermöglicht der Einsatz von MNPs und Magnetfeldern eine gute Lokalisation in vitro für die Gen- und Zelltherapie. Damit verspricht es zahlreiche Einsatzmöglichkeiten für in vivo Applikationen, in denen es zu einer lokalen Positionierung oder Anreicherung von Genen, Zellen und Wirkstoffen beitragen kann. Trotz des Potentials der MNPs darf die potentielle Toxizität oder ein physiologischer Effekt der MNPs auf die Zellen nicht unbeachtet bleiben und muss in Zukunft deutlich stärker in den Fokus rücken.