Eine Interaktionsanalyse des Nod-like-Rezeptors NLRP7

Abstract

Mutationen in NLRP7 (NOD-Like Receptor family, pyrin domain containing 7) sind für das wiederholte Auftreten von biparentalen Blasenmolen (BiBMs) verantwortlich. Typische Merkmale dieser abnormalen Schwangerschaft sind ein übermäßiges Wachstum der Plazenta, eine gestörte Entwicklung bis hin zu einem fehlenden Embryo und ein verändertes Imprintingmuster an multiplen Imprinting-Loci. Bislang wurde noch nicht geklärt, ob sich der Imprinting-Defekt vor oder nach der Befruchtung entwickelt. Unsere Gruppe konnte zeigen, dass es sich bevorzugt um einen Defekt auf dem maternalen Allel handelt. Dies könnte auf eine Störung in der Etablierung des Imprints während der maternalen Gametogenese hinweisen. Aufgrund von fehlenden Informationen über die Funktion von NLRP7 während der Gameto- und Embryogenese konnte der Zusammenhang zwischen Geno- und Phänotyp der BiBM bislang nicht geklärt werden.<br /> In dem ersten Teil dieser Dissertation wurde eine interdomän-spezifische Hefe Di- Hybrid-Analyse mit dem NLRP7-Protein durchgeführt, um vermeintliche Interaktionen der einzelnen Domänen während der Oligomerisierung ausfindig zu machen. Zusätzlich wurde ein in silico-Proteinmodell von NLRP7 in seiner inaktiven und aktivierten Form generiert um dieses mit den Interaktionen der Hefe Di-Hybrid- Analyse zu vergleichen. Die Ergebnisse beider Untersuchungen zeigten, dass die NAD-Domäne eine zentrale Rolle in dem Prozess der Oligomerisierung von NLRP7 spielt. Weiterhin wurde mittels konfokaler Mikroskopie ein pathophysiologischer Effekt bei zwei BiBM-assoziierten Missense-Mutationen und einem nicht-synonymen Single Nucleotide Polymorphism (nsSNP) nach transienter Transfektion in HEK293T- Zellen beobachtet und mit Hilfe von in silico-Analysen bewertet. Die Ergebnisse präsentierenEinblicke in die strukturellen inter-/intradomän-spezifischen Konformationsänderungen während der Aktivierung und nachfolgenden Oligomerisierung von NLRP7. Die in dieser Arbeit untersuchten Missense- Mutationen beeinflussen die intrazelluläre Formation eines Aggresoms, welches dadurch mögliche nachfolgende Signalwege stören und damit für einen der pathophysiologischen molekularen Effekte in BiBM verantwortlich sein könnte.<br /> Der zweite Teil dieser Dissertation präsentiert den Transkriptions-Repressor ZBTB16 als neuen Interaktionspartner von NLRP7. Eine Hefe Di-Hybrid-Analyse von NLRP7 gegen eine ovarielle Transkriptbibliothek identifizierte eine Interaktion mit der C-terminalen Zinkfinger-Domäne von ZBTB16. Die Interaktion wurde mittels Immunopräzipitation und konfokaler Mikroskopie in Säugerzellen bestätigt. Interaktions-Untersuchungen zwischen verschiedenen Deletionskonstrukten beider Proteine identifizierten multiple Interaktionsabschnitte von ZBTB16, welche vorwiegend mit der NACHT-Domäne von NLRP7 interagieren. Eine native Gelelektrophorese zeigte, dass beide Proteine Teil eines hochmolekularen, 480 kD großen Proteinkomplex sind. Die Überexpression von NLRP7 in HEK293T-Zellen führte zu einem nukleären Export des endogenen ZBTB16, wo beide Proteine im Zytoplasma und in juxtanukleären Aggregaten miteinander kolokalisieren. Methylierungsanalysen der imprintingspezifischen Loci H19, NESP55, PEG3 und SNRPN zeigten keine signifikanten Änderungen nach transienter Transfektion beider Proteine in HEK293T-Zellen.