Charakterisierung von Tumorstammzellen des Medulloblastoms und Analyse ihrer molekularen Regulation

Abstract

Das maligne Medulloblastom, welches aus unreifen neuralen Zellen des Kleinhirnes entsteht, zeigt eine zelluläre und molekulare Heterogenität. Die CSC (Cancer Stem Cell)-Hypothese soll zu einem besseren Verständnis der Tumorbiologie mithilfe eines hierarchisch aufgebauten Modells verhelfen. Wesentliche Aspekte dieser Hypothese sind die Selbsterneuerungs- und Differenzierungs-Fähigkeit von Tumorstammzellen. Dabei stehen die sich selbsterneuernden Tumorstammzellen unter der Kontrolle von Signalwegen, die dereguliert/aktiviert sein und zur unkontrollierten Proliferation führen können. Im Medulloblastom wurden CD133 positive Zellen mit Stammzelleigenschaften identifiziert. In der vorliegenden Arbeit wurden die Charakterisierung von Tumorstammzellen des Medulloblastoms und die Analyse ihrer molekularen Regulation zunächst mithilfe des CD133-Tumorstammzellmarkers analysiert. Hierbei wurde festgestellt, dass CD133-positive Subpopulationen der D283 Med Linie eine höhere Kapazität zur Neurosphärenbildung hatte als CD133-negative. Jedoch korrelierte die Potenz, Neurosphären auszubilden, nicht in allen Zellmodellen mit der Expression des Tumorstammzellmarkers CD133. Die verschiedenen untersuchten Medulloblastomzellen wiesen in vitro ein unterschiedliches ausgeprägtes Selbsterneuerungs-Potential auf. Des Weiteren wurden in CD133-angereicherten Zellpopulationen differentiell exprimierte Gene mittels Array-Hybridisierung identifiziert und mittels quantitativer PCR (Taqman) validiert. In der CD133-angereicherten Population konnten wir das im pränatalen Gehirn exprimierte Gen MPPED2, sowie TTR (Transthyretin) als überexprimiert identifizieren. Zellzyklus-Analysen ergaben, dass sich CD133-positive Populationen eher im Zellzyklus befinden und CD133-negative in der G0/G1-Phase. Im DAOY-Zellmodell konnten wir keine langsam proliferierenden Stammzellen mit der Methode des Label Retaining nachweisen. Die in Stammzellen und Vorläuferzellen erhöhte Aldehyddehydrogenase-Aktivität wurde als weiteres Charakteristikum untersucht. Hierbei fanden sich überlappende CD133⁺- und ALDH⁺-Populationen, mit Nachweis einer doppelt positiven Fraktion. Die Entwickungskontrollsignalwege Sonic Hedgehog, Notch und Wnt regulieren das Zellschicksal von normalen Stammzellen und von Tumorstammzellen. Die Untersuchung der Abhängigkeit der Zellen von diesen drei Entwicklungskontrollsignalwegen mittels spezifischer Inhibierung oder Stimulierung führte zu einer heterogenen Antwort in Hinsicht auf die Bildung von Neurosphären. Dieses Ergebnis weist erneut auf die Diversität des aus unterschiedlichen Zelltypen entstehenden Medulloblastoms auf. Die Differenzierungs-Fähigkeit von Neurosphären fand sich eingeschränkt; es konnten auch unter differenzierenden Bedingungen Stammzell- bzw. Vorläufermarker wie Sox2 nachgewiesen werden; eine terminale Differenzierung der Medulloblastomzellen blieb aus. Die Charakterisierung von Medulloblastom-Stammzellen und ihre Bedeutung für die Klinik der Patienten bedarf weiterer Analysen

<strong>Characterization of medulloblastoma stem cells and analysis of their molecular regulation</strong><br /> The malignant medulloblastoma, which arises from immature neural cells of the cerebellum, shows cellular and molecular heterogeneity. The CSC (cancer stem cell) hypothesis should provide a better understanding of the tumour biology using a hierarchical model. Key aspects of this hypothesis are the self-renewal and differentiation ability of cancer stem cells. The self-renewing cancer stem cells are under the control of developmental signaling pathways that can be deregulated / activated and may lead to uncontrolled proliferation. CD133 positive cells with stem cell properties were identified in the medulloblastoma. In the present work, the characterization of tumour stem cells of the medulloblastoma and the analysis of their molecular regulation were initially analysed using the CD133 cancer stem cell marker. Here it was found that CD133 positive subpopulations of the D283 Med cell line possessed a higher capacity for neurosphere formation than CD133 negative cells. However, the capacity for neurosphere formation did not correlate with the expression of the tumour stem cell marker CD133 in all cell models. The various medulloblastoma cells that were studied showed a distinct self-renewal potential in vitro. Furthermore, CD133-enriched cell populations revealed differentially expressed genes by way of microarray hybridisation. These genes were validated by way of quantitative PCR (Taqman). We were able to identify MPPED2 and TTR (Transthyretin) genes that were over-expressed in the CD133-enriched population. MPPED2 is expressed in the prenatal brain. Cell cycle analysis revealed that CD133 positive populations are predominantly active in cycling cells, while CD133 negative populations are found in the G0/G1 phase. It was not possible to detect slow-cycling stem cells in the DAOY cell model using the label retaining cell approach.The increased aldehyde dehydrogenase activity in stem cells and progenitor cells was investigated as a further characteristic. Here there were overlapping CD133⁺ and ALDH⁺ populations, with evidence of a double-positive fraction. The developmental control signaling pathways Sonic hedgehog, Notch and Wnt regulate the cell fate of normal stem cells and tumour stem cells. The study of the cells as a function of these three developmental control signaling pathways by means of specific inhibition or stimulation resulted in a heterogeneous response with respect to the formation of neurospheres. This result again demonstrates the diversity of the medulloblastoma consisting of different cell types. The differentiation ability of neurospheres was restricted. It was also possible to detect stem cell markers and progenitor markers, such as Sox2, under differentiating conditions. Terminal differentiation of medulloblastoma cells was not possible. Characterizing medulloblastoma stem cells and their significance for the patient’s clinic requires further analysis.