Biochemische, strukturelle und kinetische Charakterisierung des ungewöhnlichen <em>c</em>-Typ Cytochroms Thiosulfatdehydrogenase

Abstract

Thiosulfatdehydrogenasen sind Dihäm <em>c</em>-Typ Cytochrome mit einer ungewöhnlichen His/Cys-Koordination eines Hämes und weit verbreitet unter Bakterien. TsdA-Proteine kommen in allen Gruppen der Proteobakterien und auch in grampositiven Organismen vor. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die TsdA-Proteine aus <em>A. vinosum </em>und<em> C. jejuni</em> als typische Vertreter dieser Enzymklasse heterolog in E. coli produziert und biochemisch charakterisiert. Die Enzyme aus diesen beiden Organismen dienen als Beispiel für die zwei Funktionsweisen der TsdA-Proteine, die Oxidation von Thiosulfat und die Reduktion von Tetrathionat. In Enzymtests konnte gezeigt werden, dass die TsdA aus <em>A. vinosum</em> als Thiosulfatdehydrogenase fungiert, ähnlich wie homologe Proteine aus <em>T. intermedia </em>oder<em> P. stutzeri</em>. Im Gegensatz dazu ist die TsdA aus <em>C. jejuni</em> ein bifunktionales Enzym mit einer primären Funktion als Tetrathionatreduktase. Diese Funktion verleiht dem Enzym zusätzliche, physiologische Relevanz, da die TsdA humanpathogenen Bakterien wie <em>C. jejuni</em> einen Wachstumsvorteil in der Darmflora verschaffen könnte.<br /> Am Beispiel der TsdA aus <em>A. vinosum</em> konnte über UV-Vis Spektren gezeigt werden, dass das konservierte Cystein, das als distaler Ligand eines Hämes fungiert, pH-abhängigen und Redox-abhängigen Veränderungen unterliegt. Anhand von AvTsdA Cystein₉₆-Varianten wurde bewiesen, dass das Cystein essentiell für die katalytische Aktivität ist und eine stabilisierende Funktion innerhalb der TsdA hat. Das zweite Häm wird in der oxidierten AvTsdA His/Lys-ligiert und vollführt einen Redox-abhängigen Ligandenwechsel zu einer His/Met-Koordination im reduzierten Zustand des Proteins. Anhand von TsdA Lysin- und Methionin-Varianten konnte gezeigt werden, dass die Häm-Eisen Koordination dieses Hämes einen starken Einfluss auf, sowohl die maximale spezifische Aktivität als auch die Substrataffinität zu Thiosulfat und Tetrathionat, hat. <br /> Die AvTsdA überträgt Elektronen vermutlich zunächst auf ein Dihäm <em>c</em>-Typ Cytochrom, von dem die Elektronen auf das Eisen-Schwefel Cluster Protein HiPIP (Alvin_2274) und schließlich auf das photosynthetische Reaktionszentrum weitergeleitet werden. <em>C. jejuni</em> dagegen betreibt keine Photosynthese und die Elektronen werden von der CjTsdA auf ein Monohäm <em>c</em>-Typ Cytochrom und dann vermutlich auf die terminale <em>cb</em>-Oxidase übertragen. Mehrere Organismen wie z. B. <em>T. intermedia</em>, exprimieren ein weiteres <em>c</em>-Typ Cytochrom (TsdB), welches als Elektronenakzeptor für die TsdA dienen kann.