Entwicklung und Bewertung verschiedener Methoden zur Aktivitätsbestimmung von Ectonucleotidasen und zur Identifizierung von Inhibitoren
Entwicklung und Bewertung verschiedener Methoden zur Aktivitätsbestimmung von Ectonucleotidasen und zur Identifizierung von Inhibitoren
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DissertationPrüfungsdatum
04.05.2015Datum der Veröffentlichung
27.05.2015Erstgutachter
Müller, Christa E.Zweitgutachter
Schiedel, Anke C.Metadaten
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Inhalt
Ectonucleotidasen werden ubiquitär im Körper exprimiert und sind an vielen (patho)physiologischen Prozessen beteiligt. Sie sind daher als potentielle Arzneistofftargets von großem Interesse (z. B. in der Krebsbehandlung oder der antimikrobiellen Therapie). Für die Entwicklung neuer Wirkstoffe ist es jedoch wichtig die genaue Funktion der unterschiedlichen Enzyme und ihrer Subtypen zu kennen. Inhibitoren können hierbei als pharmakologische Werkzeuge dienen und zur Target-Validierung verwendet werden. Bisher sind nur wenige und nicht sehr potente Inhibitoren beschrieben worden. Um neue Hemmstoffe zu identifizieren, werden geeignete Methoden zur Aktivitätsbestimmung benötigt.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde daher der Malachitgrün-Assay für die Aktivitätsbestimmung der humanen NTPDase1, -2, -3 und -8 etabliert, erfolgreich auf eine Roboteranlage übertragen und validiert (Z´-Faktoren ≥ 0,71). Er ermöglicht die Detektion des bei der Enzymreaktion entstehenden Phosphats. In einem ersten High-throughput Screening (HTS) wurden verschiedene Substanzbibliotheken (insgesamt 3800 Testverbindungen) zur Identifizierung inhibitorisch aktiver Verbindungen getestet (Z´-Faktoren ≥ 0,79). Vier Treffer wurden näher charakterisiert: LE 135, Resveratrol, Tamoxifen und PSB-06126 wurden als selektive Inhibitoren einzelner NTPDase-Subtypen mit IC50-Werten im mikromolaren Bereich identifiziert. Weiterhin konnten erste Struktur-Wirkungs-Beziehungen von Anthrachinon-Derivaten an den humanen NTPDasen1, -2 und -3 abgeleitet werden.
Darüber hinaus wurden neue, auf Fluoreszenzpolarisationsmessungen beruhende Methoden zur Aktivitätsbestimmung der NTPDase1, -2, -3 und -8 entwickelt und validiert (Z´-Faktor ≥ 0.70). Diese Assays ermöglichen die direkte und sensitive Quantifizierung der bei der Enzymreaktion entstehenden Produkte ADP oder AMP im 384-Loch-Format. In einem ersten exemplarischen Screening wurden > 400 Arzneistoffe in Bezug auf ihre inhibitorische Aktivität gegenüber der humanen NTPDase3 (Z´-Faktor: 0,87) untersucht. Des Weiteren führten Untersuchungen von Polyoxometalaten zur Identifizierung des potentesten, bisher beschriebenen NTPDase1-Inhibitors K10[Co4(H2O)2(PW9O34)2]·22H2O mit einem Ki-Wert von 3,88 nM.
Für die Aktivitätsbestimmung der bakteriellen Lp1NTPDase aus Legionella pneumophila wurde ein Kapillarelektrophorese-Assay entwickelt. Er ermöglicht es das bei der Enzymreaktion gebildete AMP elektrophoretisch vom Substrat ADP zu trennen und die entsprechenden Konzentrationen über die Peakflächen zu quantifizieren. Es konnten verschiedene Anthrachinon-Derivate in Hinblick auf ihre inhibitorische Aktivität untersucht und die Verbindung mit einem 9-Phenanthryl-Rest in der 4-Position des Anthrachinon-Grundgerüstes als potentester Inhibitor des Enzyms mit einem IC50-Wert von 4,24 µM identifiziert werden.
Für die Aktivitätsbestimmung der gewebe-unspezifische Alkalische Phosphatase (TNAP) wurde ein Lumineszenzassay mit CDP-Star als Substrat etabliert und in einem ersten Screening der Metallkomplex Na20[P6W18O79]·37H2O als potentester Inhibitor (kompetitiver Hemmmechanismus) mit einem Ki-Wert von 2,27 µM ermittelt.
Abschließend wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Vor- und Nachteile der Methoden zur Aktivitätsbestimmung von Ectonucleotidasen ausführlich bewertet und diskutiert.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde daher der Malachitgrün-Assay für die Aktivitätsbestimmung der humanen NTPDase1, -2, -3 und -8 etabliert, erfolgreich auf eine Roboteranlage übertragen und validiert (Z´-Faktoren ≥ 0,71). Er ermöglicht die Detektion des bei der Enzymreaktion entstehenden Phosphats. In einem ersten High-throughput Screening (HTS) wurden verschiedene Substanzbibliotheken (insgesamt 3800 Testverbindungen) zur Identifizierung inhibitorisch aktiver Verbindungen getestet (Z´-Faktoren ≥ 0,79). Vier Treffer wurden näher charakterisiert: LE 135, Resveratrol, Tamoxifen und PSB-06126 wurden als selektive Inhibitoren einzelner NTPDase-Subtypen mit IC50-Werten im mikromolaren Bereich identifiziert. Weiterhin konnten erste Struktur-Wirkungs-Beziehungen von Anthrachinon-Derivaten an den humanen NTPDasen1, -2 und -3 abgeleitet werden.
Darüber hinaus wurden neue, auf Fluoreszenzpolarisationsmessungen beruhende Methoden zur Aktivitätsbestimmung der NTPDase1, -2, -3 und -8 entwickelt und validiert (Z´-Faktor ≥ 0.70). Diese Assays ermöglichen die direkte und sensitive Quantifizierung der bei der Enzymreaktion entstehenden Produkte ADP oder AMP im 384-Loch-Format. In einem ersten exemplarischen Screening wurden > 400 Arzneistoffe in Bezug auf ihre inhibitorische Aktivität gegenüber der humanen NTPDase3 (Z´-Faktor: 0,87) untersucht. Des Weiteren führten Untersuchungen von Polyoxometalaten zur Identifizierung des potentesten, bisher beschriebenen NTPDase1-Inhibitors K10[Co4(H2O)2(PW9O34)2]·22H2O mit einem Ki-Wert von 3,88 nM.
Für die Aktivitätsbestimmung der bakteriellen Lp1NTPDase aus Legionella pneumophila wurde ein Kapillarelektrophorese-Assay entwickelt. Er ermöglicht es das bei der Enzymreaktion gebildete AMP elektrophoretisch vom Substrat ADP zu trennen und die entsprechenden Konzentrationen über die Peakflächen zu quantifizieren. Es konnten verschiedene Anthrachinon-Derivate in Hinblick auf ihre inhibitorische Aktivität untersucht und die Verbindung mit einem 9-Phenanthryl-Rest in der 4-Position des Anthrachinon-Grundgerüstes als potentester Inhibitor des Enzyms mit einem IC50-Wert von 4,24 µM identifiziert werden.
Für die Aktivitätsbestimmung der gewebe-unspezifische Alkalische Phosphatase (TNAP) wurde ein Lumineszenzassay mit CDP-Star als Substrat etabliert und in einem ersten Screening der Metallkomplex Na20[P6W18O79]·37H2O als potentester Inhibitor (kompetitiver Hemmmechanismus) mit einem Ki-Wert von 2,27 µM ermittelt.
Abschließend wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Vor- und Nachteile der Methoden zur Aktivitätsbestimmung von Ectonucleotidasen ausführlich bewertet und diskutiert.
Klassifikation (DDC)
540 Chemie 615 Pharmakologie, TherapeutikFiene, Amelie: Entwicklung und Bewertung verschiedener Methoden zur Aktivitätsbestimmung von Ectonucleotidasen und zur Identifizierung von Inhibitoren. - Bonn, 2015. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5n-40097
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5n-40097
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author = {{Amelie Fiene}},
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Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde daher der Malachitgrün-Assay für die Aktivitätsbestimmung der humanen NTPDase1, -2, -3 und -8 etabliert, erfolgreich auf eine Roboteranlage übertragen und validiert (Z´-Faktoren ≥ 0,71). Er ermöglicht die Detektion des bei der Enzymreaktion entstehenden Phosphats. In einem ersten High-throughput Screening (HTS) wurden verschiedene Substanzbibliotheken (insgesamt 3800 Testverbindungen) zur Identifizierung inhibitorisch aktiver Verbindungen getestet (Z´-Faktoren ≥ 0,79). Vier Treffer wurden näher charakterisiert: LE 135, Resveratrol, Tamoxifen und PSB-06126 wurden als selektive Inhibitoren einzelner NTPDase-Subtypen mit IC50-Werten im mikromolaren Bereich identifiziert. Weiterhin konnten erste Struktur-Wirkungs-Beziehungen von Anthrachinon-Derivaten an den humanen NTPDasen1, -2 und -3 abgeleitet werden.
Darüber hinaus wurden neue, auf Fluoreszenzpolarisationsmessungen beruhende Methoden zur Aktivitätsbestimmung der NTPDase1, -2, -3 und -8 entwickelt und validiert (Z´-Faktor ≥ 0.70). Diese Assays ermöglichen die direkte und sensitive Quantifizierung der bei der Enzymreaktion entstehenden Produkte ADP oder AMP im 384-Loch-Format. In einem ersten exemplarischen Screening wurden > 400 Arzneistoffe in Bezug auf ihre inhibitorische Aktivität gegenüber der humanen NTPDase3 (Z´-Faktor: 0,87) untersucht. Des Weiteren führten Untersuchungen von Polyoxometalaten zur Identifizierung des potentesten, bisher beschriebenen NTPDase1-Inhibitors K10[Co4(H2O)2(PW9O34)2]·22H2O mit einem Ki-Wert von 3,88 nM.
Für die Aktivitätsbestimmung der bakteriellen Lp1NTPDase aus Legionella pneumophila wurde ein Kapillarelektrophorese-Assay entwickelt. Er ermöglicht es das bei der Enzymreaktion gebildete AMP elektrophoretisch vom Substrat ADP zu trennen und die entsprechenden Konzentrationen über die Peakflächen zu quantifizieren. Es konnten verschiedene Anthrachinon-Derivate in Hinblick auf ihre inhibitorische Aktivität untersucht und die Verbindung mit einem 9-Phenanthryl-Rest in der 4-Position des Anthrachinon-Grundgerüstes als potentester Inhibitor des Enzyms mit einem IC50-Wert von 4,24 µM identifiziert werden.
Für die Aktivitätsbestimmung der gewebe-unspezifische Alkalische Phosphatase (TNAP) wurde ein Lumineszenzassay mit CDP-Star als Substrat etabliert und in einem ersten Screening der Metallkomplex Na20[P6W18O79]·37H2O als potentester Inhibitor (kompetitiver Hemmmechanismus) mit einem Ki-Wert von 2,27 µM ermittelt.
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Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde daher der Malachitgrün-Assay für die Aktivitätsbestimmung der humanen NTPDase1, -2, -3 und -8 etabliert, erfolgreich auf eine Roboteranlage übertragen und validiert (Z´-Faktoren ≥ 0,71). Er ermöglicht die Detektion des bei der Enzymreaktion entstehenden Phosphats. In einem ersten High-throughput Screening (HTS) wurden verschiedene Substanzbibliotheken (insgesamt 3800 Testverbindungen) zur Identifizierung inhibitorisch aktiver Verbindungen getestet (Z´-Faktoren ≥ 0,79). Vier Treffer wurden näher charakterisiert: LE 135, Resveratrol, Tamoxifen und PSB-06126 wurden als selektive Inhibitoren einzelner NTPDase-Subtypen mit IC50-Werten im mikromolaren Bereich identifiziert. Weiterhin konnten erste Struktur-Wirkungs-Beziehungen von Anthrachinon-Derivaten an den humanen NTPDasen1, -2 und -3 abgeleitet werden.
Darüber hinaus wurden neue, auf Fluoreszenzpolarisationsmessungen beruhende Methoden zur Aktivitätsbestimmung der NTPDase1, -2, -3 und -8 entwickelt und validiert (Z´-Faktor ≥ 0.70). Diese Assays ermöglichen die direkte und sensitive Quantifizierung der bei der Enzymreaktion entstehenden Produkte ADP oder AMP im 384-Loch-Format. In einem ersten exemplarischen Screening wurden > 400 Arzneistoffe in Bezug auf ihre inhibitorische Aktivität gegenüber der humanen NTPDase3 (Z´-Faktor: 0,87) untersucht. Des Weiteren führten Untersuchungen von Polyoxometalaten zur Identifizierung des potentesten, bisher beschriebenen NTPDase1-Inhibitors K10[Co4(H2O)2(PW9O34)2]·22H2O mit einem Ki-Wert von 3,88 nM.
Für die Aktivitätsbestimmung der bakteriellen Lp1NTPDase aus Legionella pneumophila wurde ein Kapillarelektrophorese-Assay entwickelt. Er ermöglicht es das bei der Enzymreaktion gebildete AMP elektrophoretisch vom Substrat ADP zu trennen und die entsprechenden Konzentrationen über die Peakflächen zu quantifizieren. Es konnten verschiedene Anthrachinon-Derivate in Hinblick auf ihre inhibitorische Aktivität untersucht und die Verbindung mit einem 9-Phenanthryl-Rest in der 4-Position des Anthrachinon-Grundgerüstes als potentester Inhibitor des Enzyms mit einem IC50-Wert von 4,24 µM identifiziert werden.
Für die Aktivitätsbestimmung der gewebe-unspezifische Alkalische Phosphatase (TNAP) wurde ein Lumineszenzassay mit CDP-Star als Substrat etabliert und in einem ersten Screening der Metallkomplex Na20[P6W18O79]·37H2O als potentester Inhibitor (kompetitiver Hemmmechanismus) mit einem Ki-Wert von 2,27 µM ermittelt.
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