Aggregatbildung des Lantibiotikums Nisin mit Baktoprenolkomponenten der bakteriellen Zellwandbiosynthese

Abstract

Wie andere antimikrobielle Peptide besitzt das Lantibiotikum Nisin die Fähigkeit, eine Membran zu perforieren, wenn es in mikromolaren Konzentrationen eingesetzt wird. In Anwesenheit des bakteriellen Zellwandvorläufermoleküls Lipid II sind dafür jedoch schon nanomolare Konzentrationen ausreichend. Für den Wirkmechanismus von Nisin ist nicht nur die Porenbildung in der Membran, sondern die Bildung von großen Nisin-Lipid II-Aggregaten entscheidend, da dadurch die Zellwandbiosynthese inhibiert wird. <br /> Da sich bisherige Studien vor allem auf die Untersuchung des Porenbildungsmechanismus konzentrierten, wurde in dieser Arbeit wurde das Aggregationsverhalten des Lantibiotikums Nisin in vivo an Bakterienmembranen und in vitro an Modellmembranen analysiert. In Zellen von Bacillus subtilis wurde die Korrelation zwischen der Aggregatbildung von fluoreszenzmarkiertem Nisin und der Beschädigung der Zellmembran, die zu dem Tod der Bakterienzellen führen kann, untersucht. Es wurde festgestellt, dass die Zellmembran erst ab einer bestimmten Aggregatgröße beschädigt wurde.<br /> Der Aggregationsprozess wurde weiter unter kontrollierten Versuchsbedingungen in der Membran von unilamellaren Riesenvesikeln mittels fluoreszenzmikroskopischer Methoden untersucht. Mittels konfokaler Laserrasterikroskopie wurde die Aggregatbildung von fluoreszenzmarkiertem Nisin mit verschiedenen Baktoprenolbindungspartnern, die Bestandteil des Zellwandbiosynthesezyklus sind, visualisiert. Quantitative Analyse der Aggregatintensitäten zeigte, dass die Aggregate abhängig vom Bindungspartner unterschiedliche Größen besaßen. Die größten Aggregate entstanden nach Bindung an Lipid I und Lipid II und nur in diesen Fällen war auch eine Permeation der Membran zu beobachten. Zusätzlich zu der Membranperforierung wurden weitere destabilisierende Effekte wie eine Vesikelabschnürung beobachtet.<br /> Mittels Einzelmolekülverfolgung von Lipid II-Atto647-Molekülen nach Zugabe von Nisin wurde der Aggregationsprozess unter Verwendung eines Lichtscheibenmikroskops analysiert. Durch eine Trajektorienanalyse konnten Diffusionskoeffizienten bestimmt werden, die charakteristisch für unterschiedlich große Lipid II-Spezies waren. Mit einem einfachen, geometrischen Modell konnte die Größenordnung der Lipid II-Zahl in den Aggregaten abgeschätzt werden. Mit einer abgeschätzten Zahl von hunderten bis hunderttausenden Molekülen waren die beobachteten Aggregate deutlich größer als die putativen Oligomere aus vier Lipid II und acht Nisinmolekülen in einem 2004 von Hapser und Mitarbeitern beschriebenen Porenmodell. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass sich die Aggregatgröße entscheidend auf die Permeation und Destabilisierung der Modell- und Bakterienmembranen auswirkte und das bisher anerkannte Porenmodell überprüft werden sollte.