Alkyne lipid probes and azide detection reagents for <em>in vitro </em>enzymatic assays and highly sensitive lipid imaging

Abstract

Click chemistry has emerged as a powerful tool for the sensitive and specific labeling of biomolecules in various applications. For the design of lipid probes, a small and non-interfering tag is important to prevent substantial influence on the characteristics of the lipid. The copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) allows the bioorthogonal detection of alkyne lipids with azide bearing reporter molecules.<br /> In vitro enzymatic assays are a major source of information about the properties of enzymes and have so far been carried out mainly with radiolabeled or fluorescent probes. In this thesis, various click chemistry based <em>in vitro</em> enzymatic assays were established and the kinetic characteristics of alkyne lipid substrates were analyzed. All enzymes tested displayed the same affinity to alkyne lipids as to their natural or radiolabeled counterparts. Thus, alkyne lipids are versatile substrates for <em>in vitro</em> enzymatic assays.<br /> The demand to study the intracellular localization of lipids has led to recent progress in microscopy imaging of alkyne lipids. However, their detection is crucially dependent on the appropriate azide detection reagent. It should favor a fast and efficient click reaction and therefore a sensitive detection of the lipids. For this purpose, biotinylated azide reporters with different polyethylene spacer components were synthesized in this study and their suitability for lipid imaging in fixed cells was tested. The introduction of a copper-chelating picolyl moiety strongly increased the signal intensity derived from the alkyne lipids, allowing the highly sensitive imaging of the metabolites of alkyne-oleate, propargylcholine and alkyne-cholesterol.<br /> With the improved protocol, alkyne-cholesterol was detected at the endoplasmic reticulum (ER) and the surface of lipid droplets (LDs) in HuH7 hepatocarcinoma cells. Using stimulated emission depletion (STED) microscopy, alkyne-cholesterol positive membrane contacts between the two organelles were identified. Loading of the HuH7 cells with unlabeled lipids affected the storage of esterified alkyne-cholesterol in LDs. The cholesterol esterification step inside hepatocytes might play an important role in the maintenance of hepatic cholesterol homeostasis and the prevention of hepatocellular lipotoxicity, and will be investigated further.

<strong>Alkinlipidsonden und Azidnachweisreagenzien für in vitro-Enzymassays und die hochempfindliche Mikroskopie von Lipiden</strong><br /> Die Click-Chemie hat sich zu einem wichtigen Werkzeug bei der sensitiven und spezifischen Markierung von Biomolekülen entwickelt. Für die Markierung von Lipiden sollten besonders kleine Markergruppen verwendet werden, die die Eigenschaften des Lipids möglichst wenig verändern. Die kupferkatalysierte 1,3- Cycloaddition zwischen einem Azid und einem terminalen Alkin kann genutzt werden, um Alkinlipide mit azidmarkierten Nachweisreagenzien in einer bioorthogonalen Reaktion zu verknüpfen.<br /><em>In vitro</em>-Enzymassays liefern wichtige Informationen über die Eigenschaften von Enzymen und wurden bisher häufig mit radioaktiv oder fluoreszenzmarkierten Lipidsonden durchgeführt. In der vorliegenden Arbeit wurden mehrere auf Click-Chemie basierende i<em>n vitro</em>-Enzymassays etabliert und die kinetischen Eigenschaften von Alkinlipidsubstraten untersucht. Alle getesteten Enzyme besaßen die gleiche Affinität zu Alkinlipiden wie zu den entsprechenden radioaktiv markierten oder unmarkierten Gegenstücken. Alkinlipide sind somit geeignete Substrate für <em>in vitro</em>-Enzymassays.<br /> Der Bedarf an Erkenntnissen über die genaue Lokalisation von Lipiden innerhalb der Zelle treibt die Entwicklung der Mikroskopie von Alkinlipiden voran. Deren mikroskopischer Nachweis hängt jedoch entscheidend von einem geeigneten Azidnachweisreagenz ab, das eine schnelle und effiziente Click-Reaktion und damit einen sensitiven Lipidnachweis ermöglicht. Zu diesem Zweck wurden in der vorliegenden Arbeit mehrere biotinylierte Azidnachweisreagenzien synthetisiert, in denen Biotin und die Azidgruppe durch unterschiedliche polyethylenglykolbasierte Linker verbunden waren. Die Verwendung einer kupferchelierenden Picolylgruppe im Linker führte zu einem starken Anstieg der Signalintensität beim Nachweis von Alkinlipiden und ermöglichte so die hochempfindliche Mikroskopie der Metabolite von Alkinölsäure, Propargylcholin und Alkincholesterin.<br /> Mit dem verbesserten Protokoll wurde Alkincholesterin im endoplasmatischen Retikulum und an der Oberfläche von Lipidtröpfchen in HuH7-Leberkarzinomzellen nachgewiesen. Unter dem hochauflösenden STED-Mikroskop wurden direkte Membrankontakte zwischen den beiden Organellen beobachtet. Das Beladen der Zellen mit unmarkierten Lipiden beeinflusste die Speicherung von Alkincholesterinestern in Lipidtröpfchen. Der Teilschritt der Veresterung von Cholesterin in Hepatozyten, der möglicherweise eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Cholesterinhomöostase in der Leber und bei der Vermeidung einer toxischen Wirkung von freiem Cholesterin spielt, wird Gegenstand weiterführender Versuche sein.