Charakterisierung von PQQ-abhängigen Dehydrogenasen aus Sphingomonas wittichii RW1 und Entwicklung eines enzymatischen Verfahrens für die Quantifizierung von PQQ
Charakterisierung von PQQ-abhängigen Dehydrogenasen aus Sphingomonas wittichii RW1 und Entwicklung eines enzymatischen Verfahrens für die Quantifizierung von PQQ
View/Type of Scholarly Publication
DissertationDate of Exam
22.10.2015Date of Publication
05.11.2015Advisor
Deppenmeier, UweCo-Referee
Dahl, ChristianeMetadata
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Abstract
Die Entschlüsselung des Genoms von S. wittichii RW1 eröffnete die Möglichkeit neuartige PQQ-abhängige Dehydrogenasen zu entdecken. Es wurden alle potentiellen Chinoproteine aus S. wittichii RW1 bioinformatisch identifiziert. Dabei wurde ersichtlich, dass dieser Organismus über insgesamt 14 putative PQQ-abhängige Dehydrogenasen verfügt. Von diesen 14 Genen wurde das Gen swit_4395 in einen neuartigen Expressionsvektor kloniert. Dieser enthielt neben dem Promotor p264 aus G. oxydans 621H, das Signalpeptid pelB aus E. coli und einen Strep-Tag mit verlängerter Linkersequenz. Das rekombinante Protein Swit_4395 wurde heterolog in E. coli und homolog in S. wittichii produziert und mittels Strep-Tactin-Affinitätschromatographie gereinigt. Es hatte eine Größe von 39,3 kDa und wurde als Aldehyd-Dehydrogenase charakterisiert. Das Substratspektrum erstreckte sich dabei über aliphatische und aromatische Aldehyde, Di-, Hydroxy- und Ketoaldehyde und Butanal stellte das Substrat mit der höchsten katalytischen Aktivität dar (Vmax = 3970 ± 200 U/mg, KM = 12,3 mM). Als prosthetische Gruppe konnte PQQ identifiziert werden, wobei je ein Mol Enzym ein Mol PQQ bindet. Die Rekonstitution der Apoenzymform von Swit_4395 mit PQQ und Ca2+ konnte zudem erfolgreich durchgeführt werden. Bei der homologen Produktion des Protein Swit_4395 in S. wittichii konnte gezeigt werden, dass es sich um ein periplasmatisches Enzym handelt, das nativ als Homooktamer und Homododekamer vorkommt, wobei beide Formen katalytisch aktiv waren. Als Effekt der homologen Produktion konnte zudem eine erhöhte Toleranz gegenüber Butanal festgestellt werden, was darauf schließen ließ, dass es sich um ein Detoxifizierungs-System handelt. Zudem wurde eine potentielle Anwendungsmöglichkeit für das Protein Swit_4395 erprobt. Dazu wurde ein enzymatisches Verfahren für die Quantifizierung von PQQ entwickelt. Bei diesem Verfahren wurde die Apoenzymform mit definierten Mengen an PQQ oder Probenmaterial, sowie CaCl2 rekonstituiert und die enzymatische Aktivität mit Phenylglyoxal als Substrat und DCPIP als artifiziellen Elektronenakzeptor gemessen. Die Aktivität des Enzyms verläuft proportional zu dem Beladungszustand mit PQQ daher kann PQQ mit diesem System quantifiziert werden. Diese Methode ist enorm schnell, sensitiv und effizient, da die Rekonstitution innerhalb von Millisekunden abläuft und das Detektionslimit mit 0,05 nM sehr niedrig liegt. Zudem lassen sich bis zu 40.000 Messungen mit einer Enzympräparation durchführen. Es war möglich PQQ sowohl in zahlreichen Lebensmitteln wie Obst, Gemüse und alkoholischen Getränken nachzuweisen, als auch in den Kulturüberständen von PQQ-produzierenden Bakterien, wie G. oxydans, Ga. diazotrophicus, H. denitrificans und P. putida.
Classification (DDC)
570 Biowissenschaften, BiologieZeiser, Jessica: Charakterisierung von PQQ-abhängigen Dehydrogenasen aus Sphingomonas wittichii RW1 und Entwicklung eines enzymatischen Verfahrens für die Quantifizierung von PQQ. - Bonn, 2015. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5n-41866
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5n-41866
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