Die Funktion der putativen alkalischen Ceramidase ACER1 innerhalb des Sphingolipidstoffwechsels in <em>Arabidopsis thaliana</em>

Abstract

Sphingolipide sind eine Lipidklasse, welche in allen Eukaryoten und in einigen Bakterien eine wichtige Rolle als Zellmembranbestandteile spielen und bei vielen Zellprozessen beteiligt sind. Im Vergleich zu einer enormen Menge an Forschungsdaten über bioaktive Sphingolipide in Mensch, Ratte oder Hefe wurde erst in den letzten Jahren dem Sphingolipidstoffwechsel in Pflanzen genauere Beachtung geschenkt. Die chemische Struktur der Sphingolipide unterscheidet sich von den besser bekannten Glycerolipiden durch den Grundbaustein Ceramid. Ceramid besteht aus einer Fettsäure, welche amidisch mit einer langkettigen Base verbunden ist. Als Spaltprodukt spielt die langkettige Base in der Signaltransduktion der Zelle eine wichtige Rolle. Des Weiteren sind Ceramide das Rückgrat für Glukosylceramide und Glykosylinositolphosphorylceramide, den komplexen Sphingolipiden in Pflanzen.<br /> Ceramidasen sind Enzyme des Sphingolipidstoffwechsels. Sie sind verantwortlich für die Hydrolyse der Amidbindung zwischen der Fettsäure und der langkettigen Base, sie sind also für den Ceramidabbau verantwortlich. In Hefe wurde zudem eine reverse Aktivität alkalischer Ceramidasen festegestellt, also die acyl-CoA unabhängige Ceramidsynthese.<br /> Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde das Gen ACER1 aus Arabidopsis auf molekularbiologischer und biochemischer Ebene untersucht. Sequenzanalysen zeigen große Ähnlichkeit zu bereits beschriebenen alkalischen Ceramidasen. Sequenzanalysen prognostizieren 5 Transmembrandomänen.<br /> Die zwei heterozygoten T-DNA Insertionslinien acer1-1 und acer1-2 weisen eine erniedrigte Transmission des acer1 Null Genotypes durch den Pollen auf. Die Pollen von acer1-1 und acer1-2 sind weniger vital als die des Wildtyps und die Anzahl intakter Samen in den Schoten ist geringer. Durch eine Herunterregulierung der Expression von ACER1 mittles RNA Intereferrenz sind die Pflanzen stark in ihrem Wachstum beeinträchtigt, sie weisen einen Zwergwuchs auf. Die Überexpression hat im Gegensatz dazu keine Auswirkung auf das Pflanzenwachstum.<br /> Der Gehalt an Ceramid, das Substrat der Ceramidasen, weist keinen Unterschied auf, wenn ACER1 überexprimiert oder herunterreguliert ist. Dafür führt ACER1-Überexpression zu einem erhöhten Gehalt an Glukosylceramiden, eine Herunterregulierung führt zu einem erniedrigten Gehalt. Enzymtests in verschiedenen heterolog exprimierenden Organismen konnten keine Ceramidaseaktivität von ACER1 bestätigen. Sie lieferten allerdings viele Hinweise auf eine reverse Cearmidase Aktivität des Enzyms hin, also einen acyl-CoA unabhängige Synthese von Ceramid.<br /> Δypc1Δydc1 ist ein S. cerevisiae Stamm, dem die Aktivität der endogenen alkalischen Ceramidasen fehlt. Die Expression von ACER1 in diesem Stamm führt zu einer Akkumulation von dem meist vorkommenden Hefe-Ceramid t18:0-h26:0, während viele andere Ceramide in geringer Menge vorhanden sind. ACER1 hat also eine Affinität für bestimmte Ceramide und scheint auch eine reverse Aktivität zu besitzen.<br /> In Zukunft sollten die GIPC in den transgenen ACER1 Arabidopsislininen gemessen werden, um einen besseren Überblick über die Beeinträchtigung zu bekommen, wenn die Expression von ACER1 modifiziert ist.