Chelation as a strategy with the potential to overcome multidrug resistance in cancer

Abstract

According to the World Health Organisation cancer is the second leading cause of death in industrialized countries. In many cases treatment fails due to the development of resistance against multiple (structurally and mechanistically) unrelated anticancer drugs (<u>m</u>ulti<u>d</u>rug <u>r</u>esistance – MDR). One of the several mechanisms responsible for MDR is the reduced accumulation of drugs, which is – on the cellular level – mediated by energy dependent transport proteins like P-glycoprotein (P-gp). A promising strategy to overcome P-gp mediated MDR is to exploit the function of the transporter by selectively targeting the resistant cancer cells. <br /> Diverse compounds have been reported to show enhanced toxicity in MDR cells, but in a systematic approach using several cell line pairs and the application of a P-gp-inhibitor, it occurs, that the MDR selectivity of these compounds is often restricted to single cell line pairs and not mediated by the activity of the transport protein. In contrast, compounds identified in a pharmacogenomic approach, proved to show an enhanced activity in MDR cells as compared to their sensitive counterparts, which was found to be P-gp dependent. <br /> In the scope of this thesis, a compound library of 51 chelators around the MDR-selective thiosemicarbazone lead compound NSC73306 was designed, synthesized and their anticancer activity was evaluated against a panel of sensitive and MDR cancer cell lines. Structure activity relationships reveal a superior toxicity of NNS and NNN donor chelators as compared to ONS derivatives regardless of the resistance status of the cells.<br /> Furthermore a set of four structurally related 8-hydroxyquinoline derived Mannich-bases with increasing MDR selectivity was investigated in detail with a focus on bioinorganic chemical properties that might be characteristic for the MDR selective toxicity.<br /> Evaluation of both compound classes allows the conclusion, that chelation is necessary for MDR selective toxicity, since non-chelating derivatives lack toxicity, but alone it is not sufficient, since not every chelator is an MDR selective agent. <br /> With respect to the 8-hydroxyquinolines trends can be seen from a bioinorganic chemical point of view, since the p<i>K</i>_a values of the ligands, as well as their metal binding abilities (reflected as pM* values for iron (III) and copper (II)) seem to influence the toxicity of the ligands. Furthermore, a tendency can be observed that MDR selective ligands seem to prefer copper binding over iron binding.<br /> A biological evidence for the importance of metal binding can be seen from experiments, in which the iron (III) and copper (II) ions were co-administered to the ligands.<br /> Chelators can act as anticancer agents via various mechanisms, some of which include the formation of<u>r</u>eactive <u>o</u>xygen <u>s</u>pecies (ROS) that occur as a result of redox cycling of formed metal complexes. The redox activity of formed iron and copper complexes, and their ability to undergo intracellular redox cycling, was confirmed by means of cyclic voltammetry and spectrophotometrically monitoring of reactions with antioxidants like glutathione (GSH). <br /> Two complementary assay systems have been established, in order to measure the formation of ROS on a cellular level.

<strong>Chelatierung als Strategie zur Überwindung der Multidrug Resistenz in Krebs</strong><br /> Laut Weltgesundheitsorganisation ist Krebs die zweithäufigste Todesursache in industrialisierten Ländern. Die Chemotherapie einer Krebserkrankung ist häufig nicht erfolgreich, da es zu einer Entwicklung von (Kreuz-)Resistenzen gegen eine Vielzahl der eingesetzten Zytostatika kommt (<u>M</u>ulti<u>d</u>rug <u>R</u>esistenz – MDR). Einer der vielen Mechanismen, die für die Resistenz verantwortlich sein können ist eine verringerte Akkumulation der Chemotherapeutika im Tumor. Auf dem zellulären Level wird diese verringerte Akkumulation z.B. durch den Efflux durch energieabhängige Transportproteine, wie P-glycoprotein (P-gp) vermittelt. Eine vielversprechende Strategie, P-gp bedingte MDR zu überwinden, ist es, die Funktion des Transporters auszunutzen und die resistenten Zellen gezielt anzugreifen. <br /> In der Literatur wird von verschiedensten Verbindung berichtet, die im Vergleich zu parentalen Zellen eine erhöhte Toxizität in MDR Zellen aufweisen. Bei einer systematischen Betrachtung dieser Substanzen in einem Panel von einigen parentalen und MDR Zelllinien und unter Anwendung des P-gp-Inhibitors Tariquidar stellt sich jedoch heraus, dass die beobachtete Selektivität häufig zelllinienspezifisch und unabhängig von der Funktion des Transporters ist. Im Gegensatz dazu weisen Substanzen, die durch eine pharmakogenomische Analyse gefunden wurden, eine in MDR Zellen erhöhte Antitumoraktivität auf, die von der P-gp-Aktivität abhängig ist.<br /> Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Substanzbibliothek von 51 Chelatoren um die MDR-selektive Thiosemicarbazon-Leitstruktur NSC73306 entworfen, synthetisiert und bezüglich ihrer Antitumoraktivität gegen ein Panel von sensitiven und MDR Krebszellen untersucht. Die Analyse von Struktur-Wirkungs-Beziehungen ergab, dass Chelatoren mit NNS und NNN Donoratomen im Vergleich zu ONS Donoratom-Derivaten aktiver sind.<br /> Des Weiteren wurde ein Set von vier strukturell verwandten Mannich Basen vom 8-Hydroxyquinolin-Grundgerüst mit steigender MDR-Selektivität untersucht. Der besondere Fokus lag auf der Charakterisierung bioanorganisch chemischer Eigenschaften, die für die MDR-Selektivität verantwortlich sein könnten.<br /> Aus den Ergebnissen beider Substanzklassen lässt sich schließen, dass Chelatierung notwendig für MDR-selektive Toxizität ist, da nicht-chelatierende Derivate deutlich weniger toxisch sind, aber dass Chelatierung allein kein hinreichendes Kriterium ist, da längst nicht jeder Chelator MDR-Selektivität aufweist.<br /> Für die 8-Hydroxyquinolinderivate sind aus bioanorganisch chemischem Gesichtspunkt Trends erkennbar, die auf einen Zusammenhang zwischen sowohl den p<i>K</i>_a-Werten der Liganden als auch der Metallbindungsfähigkeit (ausgedrückt als pM*-Werte für Eisen (III) und Kupfer (II)) und der MDR-selektiven Antitumoraktivität hindeuten. Außerdem lässt sich die Tendenz erkennen, dass MDR-selektive Liganden in ihrer Metallbindung eine Präferenz für Kupfer (II) gegenüber Eisen (III) aufweisen.<br /> Ein Hinweis auf die biologische Bedeutung der Metallbindung kann aus Experimenten geschlossen werden, in denen Eisen (III)- und Kupfer (II)-Ionen mit den Liganden co-appliziert wurden.<br /> Chelatoren können durch verschiedene Wirkmechanismen als Antitumoragentien agieren. Redoxaktive Komplexe, die sich mit Metallionen bilden können, können in der Folge eines Redoxcyclings zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (<u>r</u>eactive <u>o</u>xygen <u>s</u>pecies – ROS) führen.<br /> Die Redoxaktivität der gebildeten Eisen- und Kupfer-Komplexe wurde mit Cyclischer Voltammetrie, sowie durch spektrophotometrische Untersuchungen der Reaktion mit Antioxidantien, wie Glutathion (GSH), bestätigt.<br /> Für die intrazelluläre Messung reaktiver Sauerstoffspezies wurden zwei komplementäre Assay-systeme entwickelt und etabliert.