Click-SELEX

Abstract

Aptamers are short nucleic acids that can be selected to bind specifically and with high affinity to a variety of targets, including small organic molecules and proteins. However, for a multitude of targets, traditional SELEX methods still fail to yield suitable ligands. One possible cause is the limited chemical diversity found in the mere four different building blocks from which nucleic acids are constituted. Therefore, the addition of naturally not represented functional groups, e.g. the ones found in the side chains of proteinogenic amino acids, can increase the repertoire of possible interactions of nucleic acids and thereby expand the addressable target spectrum, enabling the selection of novel high-affinity binders. <br /> Click-SELEX is a versatile method to facilitate the modular introduction of chemical entities during the SELEX process. In this approach chemical groups are introduced into the DNA library before the selection step (in situ) via click chemistry and are subsequently removed during the amplification step, thereby avoiding enzymatic incompatibility problems associated with larger nucleobase modifications. Hence, this system allows for an easy implementation of a multitude of different chemical functionalities adapted to the imposed requirements. <br /> The development of all associated methods has been validated by the selection of a highly specific aptamer (”clickmer”) interacting with the Green Fluorescent Protein (GFP). A 3-(2- azidoethyl)-indole functionalized DNA library was enriched for C3-GFP immobilized via a His-tag on magnetic beads. Traditional and next-generation sequencing of the enriched library revealed two aptamer families. C12, the most abundant monoclonal sequence, was shown to interact with high affinity with C3-GFP immobilized on beads and in solution. C12’s binding affinity towards C3-GFP was demonstrated to be critically dependent on the correct functionalization state of three positions, as omission or substitution of the indole functionalization at these nucleotides led to a complete loss of binding affinity. The C12 clickmer also displayed a high degree of specificity, being capable of differentiating between two members of the GFP family. <br /> Having pioneered the modular introduction of nucleobase functionalization the methods developed in this proof of concept study can now be applied to a variety of other functionalizations, selection strategies, and targets. The vast applicability of the click-SELEX method will rapidly advance the application of in vitro selection approaches beyond what was previously feasible, allowing, for example, the generation of aptamers to yet non-targetable molecules.

Aptamere sind kurze Nukleinsäuren, welche selektiert werden können um Zielstrukturen, zum Beispiel kleine organische Moleküle oder Proteine, mit hoher Affinität und Spezifität zu binden. Allerdings können eine Vielzahl der gewünschten Zielstrukturen mit traditionellen SELEX Methoden nicht adressiert werden. Eine mögliche Erklärung für dieses Phänomen liegt in der limitierten chemischen Diversität natürlicher Nukleinsäuren. Die Einführung von zusätzlichen funktionellen Gruppen, wie sie etwa in den Seitenketten der proteinogenen Aminosäuren vorkommen, kann das Repertoire der möglichen Interaktionen deutlich erhöhen. Dadurch kann das adressierbare Spektrum an Zielstrukturen beträchtlich erweitert werden. <br /> Click-SELEX ist eine vielseitige Methode für die modulare Einbringung von chemischen Gruppen während des SELEX Prozesses. Bei diesem Ansatz werden die chemischen Modifikationen vor dem Selektionsschritt (in situ) in die DNA Bibliotheken via ”Click-Chemie” eingeführt und anschließend im Amplifikationsschritt wieder entfernt. Dabei werden Probleme mit enzymatischer Inkompatibilität, welche häufig mit sperrigen Funktionalisierungen assoziiert sind, vermieden. Dadurch erlaubt dieses System die einfache Einführung einer Vielzahl verschiedener, an die jeweiligen Anforderungen angepasster Funktionalitäten. <br /> Die Entwicklung aller benötigten Methoden wurde durch die Selektion eines hoch spezifischen Aptamers (”Clickmers”) für das grün fluoreszierende Protein (GFP) validiert. Eine Indol-funktionalisierte DNA Bibliothek wurde für Bindung an C3-GFP angereichert, welches zuvor mittels eines His-Tag auf magnetischen Partikeln immobilisiert wurde. Traditionelle und Hochdurchsatz-Sequenzierungen der angereicherten Bibliothek erlaubten die Identifizierung von zwei Aptamerfamilien. Für C12, der am häufigsten vertretenen mono-klonalen Sequenz, konnte eine hohe Affinität gegenüber C3-GFP, sowohl immobilisiert als auch in Lösung, nachgewiesen werden. Die Bindungseigenschaften von C12 waren dabei stark von der korrekten Funktionalisierung von drei Positionen abhängig; das Auslassen oder eine Substitution der Indol-Gruppen an diesen Nucleotiden führte zu einem vollständigen Verlust der Bindungsaffinität. C12 demonstrierte auch ein hohes Maß an Spezifität, da es zwischen zwei sehr ähnlichen GFP Varianten zu differenzieren vermochte. Nachdem die Methode nun etabliert wurde, kann click-SELEX auf eine Vielzahl neuer Funktionalisierungen, Selektionsstrategien und Zielmoleküle übertragen werden. Die breite Anwendbarkeit wird die Verwendung von in vitro Selektionsmethoden in neuartigen Anwendugsbereichen ermöglichen und damit die Generierung von Aptameren gegen derzeit schwer adressierbare Ziele vorantreiben.