Mechanismen der Proteinaggregation in Neuronen von Patienten der Machado-Joseph Erkrankung

Abstract

Die Machado-Joseph Erkrankung (MJD) oder spinozerebelläre Ataxie Typ 3 ist die häufigste Form der vererbten spinozerebellären Ataxien weltweit. Die Verlängerung eines CAG-Basentriplets im ATXN3-Gen generiert einen expandierten Polyglutaminbereich im C-Terminus von Ataxin-3. Diese Verlängerung verstärkt die Aggregationneigung von Ataxin-3, sodass es zur Bildung von Natriumdodecylsulfat (SDS)-unlöslichen Aggregaten und neuronalen intranukleären Inklusionen (NIIs) kommt, ein Schlüsselkennzeichen für MJD.<br /> Die Untersuchung von MJD wird durch die Unzugänglichkeit des zu untersuchenden Gewebes, den Neuronen des zentralen Nervensystems, limitiert. Um Mechanismen zu untersuchen, die zur Aggregation von mutiertem Ataxin-3 und zur Degenerierung von MJD-patientenspezifischen Neuronen führen, wurde die Technik der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) zur Generierung von Neuronen differenziert aus Kontroll- und MJD-iPS-Zellen verwendet. Exzitatorische Stimulation von MJD-Neuronen mit dem Neurostransmitter Glutamat oder NMDA aktivierte Calpain-vermittelte Proteolyse von Ataxin-3 und nachfolgend die Bildung von SDS-unlöslichen Ataxin-3-positiven Mikroaggregaten in MJD-Neuronen, aber nicht in Kontrollzellen. Dieser Aggregationsphenotyp war neuronspezifisch, da Glutamat keine Aggregation in MJD-iPS-Zellen, -Gliazellen oder –Fibroblasten induzieren konnte. Inhibition von spannungsabhängigen Kalziumkanälen verhinderte die Bildung von SDS-unlöslichen Mikroaggregaten und unterstrich die neuronale Spezifität. Für die Verwendung in einem pharmakologischen Screening wären jedoch Assays zu bevorzugen, die keine 6 Wochen für die Expression von funktionellen Glutamatrezeptoren benötigen. Um Glutamat als Stimulus für die Erhöhung des zytosolischen Kalziums zu ersetzen, wurde ATP als Agonist für die P2-Rezeptorfamilie auf unreifen neuronalen Zellen getestet. ATP induzierte in für 2-4 Tage differenzierten MJD-Neuronen einen zytosolischen Kalziumanstieg und die Bildung von SDS-unlöslichen Ataxin-3-positiven Mikroaggregaten. ATP-Stimulation war sogar in der Lage mikroskopisch sichtbare Ataxin-3-positive NIIs in MJD-Neuronen zu induzieren, wohingegen Kontrollzellen negativ waren. Alternative Stimuli zur Erhöhung des zytosolischen Kalziums wie Coffein oder Inhibition der sarco/endoplasmatischen Reticulum Kalzium-ATPase (SERCA) konnten ebenfalls NIIs in bis zu 80% βIII-Tubulin-positiven Zellen induzieren. Trotz dieser hohen erreichbaren Effizienz, wurde gleichzeitig eine hohe Variabilität in der Effizienz zwischen unabhängigen Experimenten beobachtet. Fluktuationen in der Proteinhomöostase waren eine vielversprechende Ursache für diesen Effekt und in der Tat verschwand die Variabilität durch pharmakologische Autophagieinhibition, die zudem Ataxin-3-positive NIIs in hoher Effizienz in MJD-Neuronen induzierte. Zusätzlich erlaubte die sorgfältige Analyse und nachfolgende Kalibrierung der Medienkomponenten zu die Autophagie inhibierenden Bedingungen eine hoch effiziente und robuste Induktion von NIIs in MJD-Neuronen, aber nicht in Kontrollzellen, ohne weitere Stimulation.<br /> Diese Arbeit zeigt auf eindrückliche Weise das Potential der iPS-Zelltechnologie bei der Untersuchung von neurologischen Erkrankungen und liefert Einblicke in die Mechanismen der Aggregation von mutiertem Ataxin-3 bei der MJD.

<strong>Mechanisms of protein aggregation in neurons from patients with Machado-Joseph disease</strong><br /> Machado-Joseph disease (MJD) or spinocerebellar ataxia type 3 is the most frequent form of inherited spinocerebellar ataxias worldwide. Expansion of a CAG-triplet in the ATXN3 gene results in an extended polyglutamine repeat in the C-terminus of ataxin-3. This repeat expansion increases the aggregation propensity of ataxin-3 and thereby causes the generation of sodium dodecyl sulfate (SDS)-insoluble aggregates and neuronal intranuclear inclusions (NIIs) positive for ataxin-3, a neuropathological hallmark of MJD. <br /> The research for treatment of MJD is limited by the inaccessibility of the degenerating tissue, the neurons of the central nervous system. To investigate the mechanisms that lead to the aggregation of mutant ataxin-3 in MJD patient neurons and their subsequent degeneration, advantage of the induced pluripotent stem (iPS) cell technique was taken to generate iPS-derived neurons of MJD patients and related controls. Excitatory stimulation of MJD neurons with the neurotransmitter glutamate or NMDA activated calpain-mediated cleavage of ataxin-3, which initiated the subsequent generation of SDS-insoluble ataxin-3 microaggregates, but not in healthy controls. This aggregation phenotype was neuron-specific as glutamate failed to induce aggregation of ataxin-3 in MJD iPS cells, glia cells and fibroblasts. Furthermore, inhibition of voltage-gated calcium channels completely abolished the occurrence of SDS-insoluble ataxin-3 microaggregates underlining the neuron-specificity. However, for the applicability of pharmacological high content and high throughput assays shorter paradigms than 6 weeks for expression of functional glutamate receptors are preferred. To replace glutamate as excitatory stimulus for elevation of cytosolic calcium levels of immature neuronal cells, ATP was tested, as it is the natural ligand of the P2 receptor family that is expressed early in development. Application of ATP on neurons only differentiated for 2-4 days from neuronal stem cells induced an intracellular calcium release from endoplasmic reticulum and induction of SDS-insoluble ataxin-3 microaggregates exclusively in MJD neurons. Strikingly, ATP stimulation was able to induce even microscopically visible ataxin-3 positive neuronal intranuclear inclusions (NIIs) in MJD neurons but not in control cells. Alternative stimuli for release of calcium from intracellular stores like caffeine or sarco/endoplasmic reticulum calcium-ATPase (SERCA)-inhibition could also induce NIIs up to 80% of βIII-tubulin positive cells. Despite this possible high efficiency, in parallel a high variability in efficiency in NII formation was detected between independent experiments. Fluctuations in protein homeostasis (or proteostasis) were a promising candidate for mediating this effect and indeed, pharmacological inhibition of autophagy abolished variability and generated ataxin-positive NIIs in MJD neurons in high efficiency. Furthermore, careful analysis and subsequent calibration of medium components towards autophagy inhibiting conditions allowed a highly efficient and robust induction of NIIs in MJD neurons, but not in control cells, without any additional stimulation.<br /> This work highlights the potential of iPS cells for investigation of neurological disorders and shed light in the mechanisms underlying the aggregation of mutant ataxin-3 in MJD.