Die Rolle der Aktin-Regulation durch die Proteine Cofilin 1 und Profilin 1 für die Entwicklung von T-Zellen

Abstract

Die Regulation des Aktin-Zytoskeletts ist von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung und Funktion von Zellen. Trotz intensiver Forschung an den Regulationsmechanismen, die den Auf- und Abbau von Aktinfilamenten regulieren, stammten zu Beginn dieser Arbeit die meisten dieser Erkenntnisse in Bezug auf die Entwicklung von T-Zellen aus Studien zu Signalwegen, welche nicht einzig und alleine Aktinfilament-Remodellierung zum Ziel haben. Daher wurden in dieser Arbeit die Funktion zweier direkt an Aktin bindenden Proteine beeinflusst, um die Regulation des Aktin-Zytoskeletts im Rahmen der T-Zell Entwicklung direkt zu adressieren. Während Cofilin 1 die Depolymerisierung von Aktin-Filamenten beschleunigen kann, begünstigt Profilin die Polymerisation von Aktinfilamenten. Da der “Knockout“ von Cofilin 1 oder Profilin 1 in Mäusen jeweils zu einer frühen embryonalen Letalität führt, wurden in dieser Arbeit konditionale Knockout-Mausmodelle verwenden, in denen Cofilin 1 oder Profilin 1 in einem frühen Stadium der T-Zell Entwicklung im Thymus durch eine CD4-Cre-Rekombinase ausgeschaltet werden. Für Cofilin 1 konnte gezeigt werden, dass der Verlust des Proteins zu signifikanten Veränderungen der Aktin- Polymerisationskinetik und zu einer starken Verschiebung des F-/G-Aktin Gleichgewichts zu Seiten von F-Aktin, in Thymozyten, führt. Anders als es für andere Zelltypen zuvor beschrieben wurde, konnten in mutanten Thymozyten keine Veränderungen im Zellzyklus, der Proliferation, der Apoptose, dem Rezeptor Cycling oder der Aktivierbarkeit der Zellen durch den Verlust von Cofilin 1 festgestellt werden. Durchflusszytometrische Untersuchungen ergaben einen starken Block in der Entwicklung der mutanten Thymozyten, welche sich nicht über die positive Selektion hinaus in einzeln positive Thymozyten entwickeln können. Knochenmarktransplantations-Experimente konnten nachweisen, dass sich mutante Thymozyten auch in einem WT Thymus nicht entwickeln können, wodurch die Entwicklungsstörung auf ein zell-intrinsisches Problem zurückgeführt werden konnte. <em>In vitro</em> konnten mutante Thymozyten erfolgreich aktiviert und in CD4⁺ einzeln positive Zellen differenziert werden, wodurch gezeigt werden konnte, dass das interne Differenzierungsprogramm dieser Zellen nicht direkt beeinflusst wurde. Letztendlich konnten als funktionale Ursachen des Entwicklungsdefizits sowohl Adhäsions- als auch Migrationsdefekte in mutanten Thymozyten identifiziert werden. Durch detaillierte Analysen des Migrationsverhaltens in dreidimensionaler Umgebung konnte gezeigt werden, dass es in mutanten Thymozyten dabei zu vermehrten Ruhephasen während der Migration kommt.<br /> Der Verlust von Profilin-1 bedingte eine verminderte Polymerisationskinetik in Thymozyten unter SDF-1 Stimulationsbedingungen und eine signifikant geringere Menge an olymerisierten Aktin in diesen Zellen. Profilin-1 mutante Thymozyten wiesen einen verminderten Anteil des T-Zell Aktivierungsmarkes CD69 auf, zeigten jedoch keine Veränderungen in ihrer Aktivierbarkeit durch Antikörper. In durchflusszytometrischen Untersuchungen konnte eine verminderte Anzahl des späten einzeln positiven Entwicklungsstadieums CD4SP im Thymus sowie die Abwesenheit von CD4- und CD8-TZellen in den peripheren lymphatischen Geweben nachgewiesen werden. Des weiteren wurden eine verminderte Adhäsionsfähigkeit sowie eine verminderte Migration der Zellen beobachtet. Die Deletion der Profilin-1 Allele zu einem späteren Entwicklungszeitpunkt durch die distalLCK-Cre-Rekombinase führte zu einer starken Reduktion an peripheren zytotoxischen T-Zellen. Ergänzende Untersuchungen mit Reportermäusen konnten in diesem Zusammenhang geringe Anteile an potenziell Profilin-1 defizitären T-Zellen in Lymphozyten nachweisen.<br /> Davon unabhängig konnte das Vorkommen zweier bisher nicht zuzuordnenden T-Zell Populationen in Pfn1^GFPaktin Reportermäusen bestätigt und gezeigt werden, dass es sich hierbei um diskrete Populationen handelt. Erstmalig konnte gezeigt werden, dass sowohl Cofilin-1 als auch Profilin-1 bereits in einer sehr frühen Phase der Chemokin-stimulierten Aktin- Regulation in Thymozyten von Bedeutung sind. In Summe konnte gezeigt werden, dass eine Regulation des Aktin-Zytoskeletts durch die Proteine Cofilin 1 und Profilin 1 essentiell für die Entwicklung und die Funktion von T-Zellen ist.