Charakterisierung des viralen Erregerspektrums bei akuten Atemwegsinfekten von Kindern und Erwachsenen mittels Tiefsequenzierung

Abstract

Zu respiratorischen Viren gehören unter Anderem die in der Routinediagnostik erfassten Erreger Rhinovirus (RV), Respiratorisches Synzytialvirus (RSV), Adenovirus (ADV), Enterovirus (EV), Parainfluenzavirus Serotyp 1 - 4 (PIV 1 - 4), humanes Metapneumovirus (HMPV), humanes Coronavirus HCoV-NL63, HCoV-OC43, HCoV-229E und HCoV-HKU1 sowie humanes Parechovirus A und B (HPeV). Als Probenmaterial dienten alle im Jahr 2012 vom UKB in das Institut für Virologie verschickten Proben von Patienten mit einem akuten Atemwegsinfekt. Das Patienten- und Probenkollektiv der als positiv eingestuften Proben wurde hinsichtlich Alter, Geschlecht, Erregerverteilung und Saisonalität der Erreger charakterisiert. Im Rahmen eines Workflows, anhand dessen eine solch große Anzahl an Proben untersucht werden kann (n=737), wurden – nach zuvor durchgeführter generischer nested PCR und je nach Klarheit der Banden in der durchgeführten Elektrophorese – zwei Sequenziermethoden ergänzend angewandt: die Sangersequenzierung im Sinne der Kettenabbruchmethode und die Tiefsequenzierung, im Speziellen die Pyrosequenzierung, die anhand einer Neusynthese funktioniert und auch bei unbekanntem viralen Material möglich ist. Die Ergebnisse der Sangersequenzierung ergaben Virustreffer sowohl in ursprünglich als negativ eingestuften (u. A. Parainfluenza- und Parechovirus-Sequenzen) wie auch in ursprünglich als positiv eingestuften Proben: Die phylogenetische Analyse der erhaltenen VP1-Fragmente von zwei Cardiovirussequenzen im BLAST-Abgleich mit der Viruslibrary ergab die Zuordnung zu Saffold-2 A bzw. Saffold-2 B. Die Ergebnisse der Tiefsequenzierung, welche erfolgreich durchgeführt worden ist, sind konform mit den generischen PCRs und spiegeln das virale Spektrum akuter Atemwegsinfekte wider. Zudem ergab der tBLASTx-Abgleich 5 Rhinovirus-Sequenzen, deren Genotypisierung in der VP3-Region eine maximale Identität mit der Viruslibrary von nur 89 % zeigt, was für einen neuen Typ sprechen könnte. In Conclusio können die genannten Ergebnisse der ständigen Optimierung der Diagnostik bei akuten Atemwegsinfekten dienen. Die Tiefsequenzierung in Verbindung mit generischer Amplifikation birgt zudem viele Vorteile hinsichtlich der Detektion viralen Materials, muss dafür aber noch im zeitlichen und wirtschaftlichen Sinne angepasst werden.

Next-generation-sequencing: Viral pathogens in respiratory tract infections.<br /> Respiratory tract infections belong to the most common diseases in humans. They are responsible for 4 to 12 % of all annual deaths worldwide. The majority of pathogens causing respiratory tract infections comprise viruses with a mostly human to human circulation. Besides a constant prevalence of respiratory tract infections, pandemic outbreaks as the occurrence of Severe acute respiratory syndrome associated Coronavirus (SARS-CoV) in 2003/2004 and the occurrence of Middle East respiratory syndrome Coronavirus (MERS-CoV) in 2014/2015 support the major threat of viral respiratory tract infections to the human health.<br /> The discovery of respiratory viruses showed great success over the last 15 years due to a development of detection methods of viral pathogens: Whereas during the last century cell culture isolation methods were applied, during the last 15 years the Polymerase Chain Reaction (PCR) followed by sanger sequencing was mainly used to detect new respiratory viruses. Next-generation-sequencing is now a new method to detect viruses and will advance viral research and clinical diagnostics.<br /> PCR is a method to amplificate viral material. A specific version is the generic PCR: Primer bind to conserved motives of viral RNA or DNA. These motives code for enzymes which are necessary for viral replication and are therefore represented not only in species but whole genera and families. We used generic PCR with primers depending on 29 viral families and genera to amplificate viral material of patients with respiratory tract infections, whose samples were sent to the Institute of Virology during 2012. We first pooled all samples. After application of gel electrophoresis sanger sequencing (sequencing by chain termination) was used for those pools which were clearly separated. Next-generation-sequencing (in our case pyrosequencing, sequencing by synthesis of DNA and detection of light emission) was used for pools whose separation by electrophoresis appeared not that clear. The results of pyrosequencing were then bioinformatically analyzed and compared with a private viruslibrary using a basic local alignment search tool (BLAST).<br /> We first of all characterized the pools in which viral material was detected by the diagnostical respiratory panel of the Institute of Virology at Bonn (positive tested by Reverse Transcriptase PCR which covers the 14 mostly detected viral pathogens in respiratory tract infections). In originally negative tested pools we detected viral sequences of the family Paramyxoviridae, the subfamiliy Alphaherpesvirinae and the genera Parechovirus and Enterovirus. In originally positive tested pools we additionally detected Cardioviruses. Pyrosequencing was done successfully and the results reflected the known viral spectrum of respiratory tract infections in humans. We detected a possible new variation of Rhinovirus C (maximal identity of 89 %) and a murid herpesvirus 4.<br /> We compared two methods for detecting viral RNA or DNA: sanger sequencing is a very specific and precise method which can be performed quickly. The Realtime-PCR as a variation is very important to determine the exact amount of viral material and has therefore a major clinical relevance. By using Next-generation-sequencing on viral material which was amplified by a generic PCR it is possible to describe a whole viral spectrum. Also it increases the probability to discover new variations of viral species.