Generierung und Charakterisierung eines <em>in vivo</em> Modells zur BAG3^P209L-Mutation im Herzmuskel

Abstract

Myofibrilläre Myopathien sind Erkrankungen der Muskulatur mit teilweiser Beteiligung der Herzmuskulatur, die oft einen frühzeitigen Tod zur Folge haben. Dabei macht sich das Leitsymptom einer Myofibrillären Myopathie, eine progressive Muskelschwäche, typischerweise in der vierten Lebensdekade bemerkbar.<br /> Die Myofibrilläre Myopathie, die durch einen spontanen Basenaustausch von Prolin gegen Leucin an Position 209 im BAG3-Gen verursacht und als P209L-BAG3opathie bezeichnet wird, ist hingegen durch einen frühen Ausbruch und einen sehr progressiven Krankheitsverlauf, unter anderem mit einer selten vorkommenden schweren restriktiven Kardiomyopathie, charakterisiert. Das Cochaperon BAG3, welches in Zellen der quergestreiften Muskulatur an die Z-Scheiben lokalisiert, trägt als Bestandteil des CASA-Komplexes dazu bei, dass verbrauchte Z-Scheibenproteine dem Lysosom zugeführt und dort degradiert werden.<br /> In elektronenmikroskopischen Aufnahmen betroffener Muskeln kann eine Disintegration von Z-Scheiben und eine Aggregatbildung durch Akkumulation fragmentierter Filamente, Mitochondrien und Vesikel beobachtet werden.<br /> Warum es zu den diesen pathologischen Veränderungen und der Bildung von Aggregaten kommt und wie diese mechanistisch zu erklären sind, ist bis heute nicht verstanden. Deshalb sind die Aufklärung der Mechanismen, die dieser Krankheit zu Grunde liegen, und die darauf basierende Erforschung möglicher Behandlungsmethoden von großem Interesse.<br /> In dieser Arbeit wurde daher die Generierung und Charakterisierung unterschiedlicher transgener BAG3^P209L-eGFP-mES-Zelllinien und Mausmodellen etabliert. Dazu erfolgte die Herstellung unterschiedlicher BAG3^P209L-Konstrukte, die zur Visualisierung der Lokalisation des Proteins an einen eGFP-Reporter gekoppelt (BAG3^P209L-eGFP) und untersucht wurde. Hierbei war die Expression einerseits unter Kontrolle des Kardiomyozyten-spezifischen αMHC-Promotors, was eine Untersuchung des Einflusses der BAG3^P209L-Mutation auf die Herzmuskulatur und die daraus resultierenden restriktive Kardiomyopathie erlaubt. Andererseits sollte ein weiteres transgenes Mausmodell mit einer induzierbaren ubiquitären BAG3^P209L-eGFP-Expression (β-Aktin-Promotor) generiert werden, um die Expression des mutierten Cochaperons auch in der Skelettmuskulatur und in anderen Organen untersuchen zu können. Auch den Beginn der Krankheit und die Progression der Myofibrillären Myopathie verfolgen zu können, war hierbei von großem Nutzen. Bei diesem Modell kann die BAG3^P209L-eGFP-Expression <em>in vitro</em> durch Applikation einer Cre-Rekombinase oder in vivo durch Einkreuzen eines transgenen Cre-Männchens induziert werden.<br /> Während die Expression von BAG3^P209L-eGFP in den transgenen Tieren heterogen und nicht hoch genug war, um eine Beeinträchtigung der Entwicklung bzw. veränderte Herzfunktion herbei zu führen, konnten der humanen Pathologie entsprechend in über der Hälfte der BAG3^P209L-eGFP-exprimierenden Kardiomyozyten ein Rückgang der Z-Scheibenstruktur und eine BAG3^P209L-eGFP- und α-Aktinin-Aggregatbildung detektiert werden. Die degenerativen Muskel-veränderungen und die Bildung der BAG3^P209L-eGFP-Aggregate stand dabei in Zusammenhang mit einer deutlich verringerten Mobilität des BAG3^P209L-eGFP-Proteins. Diese Kardiomyozyten zeigten ebenso eine Dislokalisation der Z-Scheibenproteine Myopodin und Filamin C, Interaktionspartner von BAG3 und Substrat im CASA-Mechanismus, was auf eine Beeinträchtigung des CASA-Mechanismus hinweist. Ebenso konnte Desmin, das in der quergestreiften Muskulatur vorherrschende Intermediärfilament, in den Aggregaten nachgewiesen werden, was zeigte, dass die Expression von BAG3^P209L-eGFP in Kardiomyozyten zu einer sekundären Desminopathie führte. Im Einklang mit der beobachteten Auflösung des Zytoskeletts stand dabei die schwächere Titinexpression in den Bereichen, in denen BAG3^P209L-eGFP-Aggregaten vorlagen.<br /> Durch Verwendung des CAG-Promotors in einem weiteren transgenen Mausmodell konnte eine konditionale BAG3^P209L-eGFP-Expression erreicht werden. Dies bietet den Vorteil den Beginn der Erkrankung zu evaluieren und erlaubt die Untersuchung der BAG3^P209L-eGFP-Expression insbesondere in der Skelettmuskulatur und anderen Organen.<br /> Erste Untersuchungen von Organen eines embryonalen Entwicklungsstadiums zeigten eine ubiquitäre Expression des Proteins, die besonders in Zellen der quergestreiften Muskulatur sehr stark war.