Erforschung und Etablierung von microRNA als forensischer Biomarker zur Identifikation biologischer Spurenarten

Abstract

Spuren von forensisch-biologischem Interesse sind kleine Antragungen von Blut, Sekreten oder Gewebefragmenten an oder auf Personen, Oberflächen oder Gegenständen. Ihre Analyse ermöglicht nicht nur den Rückschluss auf spurenlegende Personen (beispielsweise Täter oder Opfer) durch Individualisierung anhand von DNA-Profilen, sondern kann auch Informationen zu einem Handlungsablauf liefern, etwa durch die Klärung der körperlichen Herkunft der Spur. Da die ‚klassischen‘ Verfahren zur Spurenartidentifikation eine Reihe von Nachteilen aufweisen, werden seit einigen Jahren alternative, nukleinsäurebasierte Herangehensweisen erforscht. MiRNAs besitzen neben der Grundvoraussetzung zelltypspezifischer Expression und der Co-Analysierbarkeit mit DNA weitere Charakteristika – allem voran ihre intrinsisch hohe Widerstandsfähigkeit gegenüber Degradation – durch die sie in besonderem Maße für die Anwendung in typischerweise nur in geringen Mengen vorhandenem, beeinträchtigtem forensischen Spurenmaterial geeignet sind. <br /> Die in dieser Dissertationsschrift zusammengefassten Studien befassten sich daher mit der Identifikation robuster miRNA-Marker für die forensisch relevantesten Körperflüssigkeiten Blut, Speichel, Sperma, Vaginalsekret und Menstruationsblut sowie erstmalig mit der miRNA-basierten Identifikation der Organgewebe Gehirn, Lunge, Leber, Niere, Herzmuskel, Skelettmuskel und Haut im forensischen Kontext.<br /> Um reliable Aussagen zur Ausgangsmenge einer untersuchten miRNA zu erhalten und verlässlich nur wenig unterschiedliche Expressionsniveaus erfassen zu können, erfordert die angewendete RT-qPCR-Methode eine stringente, für die gegebenen Versuchsbedingungen optimierte Datennormalisierung zur Eliminierung nicht-biologischer Varianzen. Hierfür wurden zunächst in zwei separaten Studien jeweils eine Gruppe von Referenzgenen (unter den gegebenen Bedingungen zwischen den Körperflüssigkeiten beziehungsweise Organgeweben möglichst stabil exprimierte snoRNAs oder snRNAs) ermittelt und validiert.<br /> Eine unvoreingenommene Auswahl differentiell zwischen den untersuchten Körperflüssigkeiten beziehungsweise Organgewebe exprimierter miRNA-Kandidaten wurde mit Hilfe von Microarray-Experimenten getroffen und anschließend mittels RT-qPCR analysiert. Die Marker, die dabei in vereinigten Proben mehrerer Individuen die besten Trenneigenschaften aufwiesen, also in ihrer Zielspurenart deutlich höher exprimiert waren als in den verbleibenden Spurenarten, wurden anschließend in Einzelproben evaluiert, wodurch die Analyse durch die Ergänzung um die interindividuellen Unterschiede vervollständigt wurde.<br /> Mit der Entwicklung eines Entscheidungsalgorithmus unter Einsatz der Diskriminanzanalyse gelang es, alle fünf Körperflüssigkeiten anhand der Expressionsniveaus von vier miRNAs in Einzelquellproben zu unterscheiden. Der entwickelte Entscheidungsbaum wurde anschließend in bis zu 36 Jahre alten Spuren, verblindeten Proben und Mischungen mehrerer Körperflüssigkeiten getestet und zeigte auch hier, insbesondere für die Identifikation von Sperma und Blut im allgemeinen Sinne (venöses Blut und Menstruationsblut) gute Ergebnisse.<br /> Eine statistisch valide Unterscheidung der Gehirn-, Leber-, Nieren-, Herzmuskel-, Skelettmuskel- und Hautproben von den jeweils anderen Organgewebeproben gelang durch die Anwendung binär logistischer Regressionsanalysen. Mit kleinen Einschränkungen konnte das erarbeitete Klassifikationsmodell im Anschluss auf gealterte Organabriebproben, verwesendes Organgewebematerial, Mischungen mehrerer Organgewebe und Asservate von simulierten Gewaltdelikten mit Einsatz von Stich- und Schusswaffen erfolgreich angewendet werden. Zudem wurde die vollständige Kompatibilität mit dem DNA-Arbeitsablauf gezeigt.<br /> Die in dieser Dissertationsschrift zusammengefassten Arbeiten stellen mit ihren höchsten Standards genügenden, gemäß den MIQE-Richtlinien dokumentierten miRNA-Expressionsmessungen sowie dem bias-freien, statistisch reliablen Auswertungsgang die Grundlage für den Ausbau der Methode bis hin zu einer angestrebten Anwendung in der forensisch-genetischen Fallarbeit dar.