Molekulare Charakterisierung des trockenstressinduzierten Gens CpGRP1 isoliert aus der Wiederauferstehungspflanze Craterostigma plantagineum

Abstract

Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht die Untersuchung des glycinreichen Proteins CpGRP1 aus der Wiederauferstehungspflanze C. plantagineum, beziehungsweise der für dieses Protein kodierenden Gensequenz und deren Promotor. Das CpGRP1-Gen rückte in den Fokus des Interesses, da eine Beteiligung dieses Gens an der Trockenstressantwort von <em>C. plantagineum</em> angenommen wird. Sowohl die Menge an vom CpGRP1-Gen abgelesenem Transkript als auch die Menge an davon synthetisiertem Protein nimmt in <em>C. plantagineum</em> durch Trockenstress zu. Schwerpunkte dieser Arbeit liegen auf den Bereichen (vergleichende) Promotoranalyse, Expressionsanalyse durch Promotor-GUS-Linien und der Erzeugung von CpGRP1-Überexpressionslinien. Die Analyse des CpGRP1 Promotors zeigt, dass die beiden größten Promotorfragmente p584 und p548 nicht nur eine gleichermaßen starke Aktivierung des CpGRP1-Promotors durch Trockenstress, sondern auch das gleiche Entwicklungs- und Gewebespezifische Expressionsmuster auslösen. Durch die Expression des GUS-Reportergens unter Kontrolle des nativen Promotors von CpGRP1 in <em>A. thaliana</em> zeigte sich, dass der Promotor im heterologen System nicht durch Trockenstress aktiviert wird. Möglicherweise liegt dies an Unterschieden im Set an Transkriptionsfaktoren das in den verschiedenen Arten nach einer Trockenstresssituation im Zellkern für eine Bindung verfügbar ist. Weiter ergab eine Untersuchung der GUS-Linien, dass der CpGRP1-Promotor nicht nur in Blättern, sondern auch in Wurzeln, Teilen des Stils und Teilen der Blüte aktiv ist und, dass in allen Stadien der pflanzlichen Entwicklung vom, Keimling bis zur blühenden Pflanze, Promotoraktivität vorhanden ist. Der Vergleich zwischen der Promotorregion des CpGRP1-Gens und der Promotorregionen der homologen Gene LbGRP1 (aus <em>Lindernia brevidens</em>) und LsGRP1 (aus <em>Lindernia subracemosa</em>) zeigt, dass die Promotorarchitektur Einfluss auf die Menge an gebildeten Transkript hat. So verfügt der Promotor von CpGRP1 über konservierte cis-Elemente, die dem Promotor des Gens LsGRP1 aus der Trockenstress sensitiven Art<em> L. subracemosa</em> fehlen. Das Expressionslevel von CpGRP1 nach Trockenstressbehandlung ist analog dazu deutlich höher als das Expressionslevel von LsGRP1 nach Trockenstressbehandlung. <em>L. brevidens</em> nimmt in Bezug auf cis- Elemente und Expressionslevel eine intermediäre Position ein. Sechs der untersuchten CpGRP1- Überexpressionslinien (6, A, C, F, J, L) zeigen eine signifikante verbesserte Trockenstresstoleranz im Vergleich zum Wildtyp. Die Übersexpression von CpGRP1 scheint keinen negativen Einfluss auf Wachstum und Entwicklung der transgenen Pflanzen zu haben. Einige Linien zeigen im Gegenteil sogar einen signifikant größeren Rosettendurchmesser als der Wildtyp. Unter Berücksichtigung der bisherigen Ergebnisse scheint CpGRP1 daher ein geeignetes Kandidatengen zu sein, durch dessen Überexpression in Nutzpflanzen die Trockenstresstoleranz dieser Arten verbessern werden könnte ohne einen negativen Einfluss auf Wachstum und Entwicklung auszuüben