MicroRNA vermittelte Regulation der Expression von Mtss1 während der Entwicklung des Kleinhirns der Maus

Abstract

Die Entwicklung und Differenzierung des Cerebellums ist von einer regelgerechten Neuritogenese verschiedener Zelltypen abhängig. Dies erfordert eine ständige Umgestaltung des Zytoskeletts und eine Regulation der Zellform. Unsere Arbeitsgruppe konnte zuvor bereits zeigen, dass das Aktin-interagierende Protein Mtss1 (metastasis suppressor 1) entwicklungsspezifisch in Körnerzellen des Cerebellums exprimiert wird. Darüber hinaus ist die Neuritogenese von Körnerzellen durch einen Wechsel der Spleißvariante begleitet, wobei Exon 12 durch Exon 12a ersetzt wird. Wie diese entwicklungsabhängigen Prozesse reguliert werden ist noch weitgehend unklar. Da Mtss1 mehrere putative microRNA (miRNA) Bindestellen an dessen 3’UTR besitzt, wurde hier die Frage gestellt, inwiefern miRNAs an dieser Regulation beteiligt sein könnten. Durch Microarray Analysen an Kleinhirnen von Mäusen der Phasen P8 und Adult konnte ein direkter Vergleich der Expressionsniveaus verschiedener miRNAs vorgenommen werden und damit entwicklungsabhängig regulierte miRNAs identifiziert werden. Unter Einbeziehung verschiedener Datenbanken konnten mehrere potentielle miRNA Kandidaten identifiziert werden, die gemeinschaftlich in wichtige Signalwege eingeordnet werden konnten. Des Weiteren konnte durch Luciferase-basierte Reporterassays gezeigt werden, dass insbesondere miRNAs des miR-182 clusters für die direkte Regulation von Mtss1 verantwortlich sind. Die funktionelle Rolle von miR-182 wurde an primären Körnerzellkulturen untersucht. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass miR-182 direkt die Expression von Mtss1 reguliert und dies mit einer veränderten Dendritenkomplexität verbunden war.

The development and differentiation of the cerebellum is critically dependent on concerted migration of all cerebellar cell types. This requires constant rearrangement of the cytoskeleton and regulation of cell shape. Recently, we could show that the expression of the actin-membrane linking IMD protein Mtss1 is developmentally regulated in cerebellar granule cells. Furthermore, neuronal maturation of the cerebellum is accompanied by a switch of Mtss1 splicing where exon 12 in replaced by the CNS-specific isoform 12a (Glassmann et al., 2007). How these processes are regulated is currently not known. Here, we asked whether microRNAs (miRNAs) may play a role in this scenario. Therefore we used microarray analysis to compare the relative expression levels of miRNAs in the cerebellum of P8 and adult mice. We identified several miRNAs to be differentially regulated in the developing cerebellum. Using TargetScan and other databases, we identified potential miRNA binding sites in the 3’UTRs of IMD-protein family members. For Mtss1 we could show regulation by several of the predicted microRNAs, especially the miR-182 cluster by using a sensor assay based on the Dual-Luciferase System. We also carried out pathway analysis of the verified miRNAs using miRPath to assess their biological function. Furthermore we could confirm the effect of miRNA targeting on arborization during primary granule cell differentiation.