Influence of the Conformation of Conotoxins on their Bioactivity

Abstract

In the last decade peptides filled the gap between small molecule drugs and biologics as therapeutics. A rich source of such peptides represents the venom of different animals evolved over millions of years. Conotoxins are small, disulfide-rich neuropeptides isolated from cone snails of the genus Conus, which act on different biological targets like ion channels or receptors. These toxins contain a complex cocktail of bioactive substances and are utilized for self-defence or hunting prey. With over 700 species known, these marine invertebrates reveal a large potential of novel pharmacologically active molecules, e.g. for the treatment of severe and chronic pain. Although peptide synthesis is established nowadays, preparation and characterization of disulfide-rich peptides is still a challenge. The formation of different disulfide isomers is one main issue facilitating the elucidation of such disulfide-rich peptides and proteins. <br /> The aim of this work was to investigate the folding of small multiple disulfide-bridged peptides under different conditions and perform structure-activity relationship studies of the resulting products. Within the scope of this project different conotoxins were synthesized by solidphase peptide synthesis. Disulfide formation was achieved by different methods i.e. oxidative self-folding, oxidation in Ionic Liquids and successive oxidation in combination with an orthogonal protecting group strategy. The oxidized conotoxins were systematically investigated and characterized with different analytical methods. Elucidation of the final three-dimensional structure was performed by NMR spectroscopy. Furthermore, determination of the disulfide connectivity was investigated by different methods of mass spectrometric analysis (LC-ESI and MALDI) after partial reduction and derivatization. The results of all applied analytical methods revealed their advantages and limitations for the discrimination of different disulfide isomers within conotoxins depending on primary amino acid sequence. Biological testing of the synthesized peptides on ion channels was performed in parallel with computational studies to enlighten the structure-activity relationships. The work presented in this thesis significantly extends the knowledge about conotoxins and disulfide formation, their impact with respect to biological activity, and the challenging characterization and structure elucidation procedures.

<strong>Auswirkung der Faltung von Conotoxinen auf ihre Biologische Aktivität</strong><br /> In den letzten Jahrzehnten haben Peptidtherapeutika begonnen, die Lücke zwischen niedermolekularen Arzneimitteln und Biopharmazeutika zu schließen. Eine reiche Quelle für solche Peptide stellen die Giftstoffe verschiedener Tiere dar, die sich über Millionen von Jahren entwickeln konnten. Conotoxine sind kleine, disulfidverbrückte, neuroaktive Peptide, die verschiedene biologische Ziele wie Ionenkanäle und Rezeptoren beeinflussen und aus dem Gift der Kegelschnecke der Gattung Conus isoliert werden. Dieses Gift besteht aus einem komplexen Cocktail aus bioaktiven Substanzen und wird von der Schnecke zur Selbstverteidigung oder zur Jagd eingesetzt. Mit über 700 bekannten Spezies bergen diese wirbellosen Meerestiere ein großes Potential für neuartige, pharmakologisch wirksame Moleküle, z.B. zur Behandlung von akuten und chronischen Schmerzen. Obwohl die Peptidsynthese heutzutage etabliert ist, stellt die Herstellung und Charakterisierung von disulfidverbrückten Peptiden immer noch eine Herausforderung dar. Hierbei ist die Bildung von unterschiedlichen disulfidverbrückten Peptidisomeren ein Hauptproblem, welches die Aufklärung disulfidverbrückter Peptide und Proteine erschwert. <br /> Das Ziel dieser Arbeit war es, die Faltung von kleinen, mehrfach disulfidverbrückten Peptide unter verschiedenen Bedingungen zu analysieren und Struktur-Aktivitätsuntersuchungen der erhaltenen Produkte durchzuführen. Im Rahmen dieses Projektes wurden unterschiedliche Conotoxine mittels Festphasenpeptidsynthese hergestellt. Zur Ausbildung der Disulfidbrücken wurden verschiedene Methoden eingesetzt: oxidative Selbstfaltung, Oxidation in ionischen Flüssigkeiten und stufenweise Oxidation in Verbindung mit einer orthogonalen Schutzgruppenstrategie. Die oxidierten Conotoxine wurden anschließend funktionell untersucht und durch verschiedene analytische Methoden charakterisiert. Mittels NMR-Spektroskopie wurden die dreidimensionalen Strukturen der erhaltenen Peptide aufgeklärt. Weiterhin konnte nach partieller Reduktion und Derivatisierung die Disulfidverbrückung durch verschiedene massenspektrometrische Verfahren (LC-ESI und MALDI) bestimmt werden. Die Ergebnisse zeigen die jeweiligen Vorteile und Limitierungen der verwendeten analytischen Methoden hinsichtlich der Unterscheidung verschiedener disulfidverbrückter Conotoxinisomere in Abhängigkeit von ihrer primären Aminosäuresequenz. Parallel zu den biologischen Testungen der hergestellten Peptide wurden computerbasierte Untersuchungen durchgeführt um ihre Struktur-Aktivitätsbeziehungen zu analysieren. Die vorgestellte Dissertation erweitert das Wissen über Conotoxine und die Bildung von Disulfidbrücken mit ihren Auswirkungen auf die biologische Aktivität und demonstriert darüber hinaus die schwierige Strukturaufklärung und Charakterisierung.