Mechanobiologische Untersuchungen zur Rolle von Keratin, Aktin und Adhärenzverbindungen während der Differenzierung epithelialer Zellen <em>in vitro</em>

Abstract

Bei genetischen Erkrankungen wie Epidermolysis bullosa simplex sind die mechanischen Eigenschaften der Hautzellen verändert und die Integrität der Haut gestört, wodurch ihrer Fragilität erhöht ist und eine funktionelle Schutzfunktion nicht länger aufrecht erhalten werden kann. Grund hierfür sind häufig Veränderungen des Proteins Keratin, welches als zytoskelettaler Hauptbestandteil epidermaler Zellen maßgeblich für ihre mechanischen Eigenschaften und die Aufrechterhaltung einer integeren Schutzfunktion verantwortlich ist. Um Hautkrankheiten wie Epidermolysis bullosa simplex (EBS) detailliert zu verstehen und mögliche Heilungsansätze zu generieren, müssen die genauen Ursachen der Krankheit aufgeklärt werden.<br /> Aus diesem Grund beschäftigte sich die vorliegende Arbeit mit der Analyse der mechanischen Eigenschaften von Zellen mit unterschiedlichen Keratinnetzwerken, welche unter anderem die EBS-assoziierte Mutation R131P im Keratin 14 tragen. Hierfür wurden in dieser Arbeit mittels Rasterkraftmikroskopie die Zellelastizitäten von Kontroll-Keratinozyten, keratinfreien Keratinozyten sowie von Keratinozyten, welche nur bestimmte Keratine exprimieren, analysiert. Für keratinfreie Keratinozyten wurde eine signifikante Reduzierung der Zellelastizität nachgewiesen, während die Zellelastizität in keratinfreien Keratinozyten, welche das Keratin 14 exprimieren sich nicht von der Steifigkeit der Kontrollzellen unterschied. Überraschenderweise führte die Expression von Keratin 14 mit der EBS-assoziierten Mutation zu einer reduzierten Zellsteifigkeit, welche noch geringer war als die der keratinfreien Keratinozyten. <br /> Die Untersuchung der Zellelastizität unter Kalziumeinfluss in vitro zeigte für Keratinozyten mit verschiedenen Keratinnetzwerken eine signifikante Erhöhung der Zellsteifigkeit. Die Elastizität der Kontrollzellen unterschied sich unter Kalziumeinfluss signifikant von der Elastizität von Zellen mit veränderten Keratinnetzwerken und verdeutlichte dadurch die enorme Bedeutung eines funktionellen Keratinnetzwerkes für die Ausbildung einer intakten Haut.<br /> Desweiteren konnte in der vorliegenden Arbeit erstmals gezeigt werden, dass die Erhöhung der extrazellulären Kalziumkonzentration zu einer signifikanten Beschleunigung der Aktinfaserreorientierung infolge uniaxialer, zyklischer Dehnung führt. Anhand von vergleichenden Dehnungsexperimenten an Einzelzellen und konfluenten Zellschichten, in Ab- und Anwesenheit von Kalzium, konnten mechanosensitive, kalziumabhängige Adherens Junctions als mechanosensitiver Mechanismus und Grund für die beschleunigte Reorientierung identifiziert werden. Als zentraler Bestandteil dieses Mechanismus konnte das Protein alpha-Catenin ausgemacht werden, welches für die kalziumabhängige, adherens junctions-vermittelte Aktinfaserreorientierung von großer Bedeutung ist, wie die reduzierte<br /> Aktinfaserreorientierung in alpha-Catenin-freien Zellen gezeigt hat. Die adherens junction-vermittelte Aktinfaserreorientierung konnte in dieser Arbeit als zusätzlicher Mechanismus der Aktinfaserreorientierung identifiziert werden, welcher die Ausbildung kalziumabhängiger Adhärenzverbindungen voraussetzt und aufgrund dessen nur in konfluenten Zellschichten unter Kalziumeinfluss aktiv ist. In diesen Zellen führt er nicht nur zu einer beschleunigten Reorientierung sondern sogar zu einer Erhöhung der maximalen Aktinfaserreorientierung senkrecht zur Zugrichtung.