Untersuchungen zur Erweiterung des Substratspektrums von Gluconobacter oxydans
Untersuchungen zur Erweiterung des Substratspektrums von Gluconobacter oxydans
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DissertationPrüfungsdatum
15.12.2017Datum der Veröffentlichung
29.01.2018Erstgutachter
Deppenmeier, UweZweitgutachter
Dahl, ChristianeMetadaten
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Inhalt
Die vorliegende Arbeit befasste sich mit einem bislang weitgehend unbearbeiteten Bereich der Stammoptimierung des biotechnologisch und industriell wichtigen Essigsäurebakteriums Gluconobacter oxydans. Dieser Organismus ist aufgrund einer fehlenden enzymatischen Ausstattung sowie nicht vorhandener geeigneter Importsysteme nicht in der Lage, Di-, Oligo- und Polysaccharide als Kohlenstoffquelle nutzen zu können. Gerade aus industrieller Sicht und im Hinblick auf bioökonomische Prozessoptimierungen ist eine Erweiterung des Substratspektrums von G. oxydans um diese, im Vergleich zu Monosacchariden oftmals günstigeren und nachhaltigeren Substrate, äußerst wünschenswert. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde in dieser Arbeit eine neuartige Strategie entwickelt, die auf der heterologen Produktion geeigneter Hydrolasen mit anschließender Translokation in das Periplasma basierte.
Der erste Schritt bei der Entwicklung eines geeigneten Expressionssystems war dabei die Identifikation von Sec-abhängigen Signalsequenzen, durch die eine effiziente Translokation der heterolog produzierten Hydrolasen vermittelt werden sollte. Mittels des Reporterenzyms PhoA konnte die Translokationseffizienz der verschiedenen Signalpeptide in G. oxydans quantifiziert und das effizientestes Signalpeptid identifiziert werden. Gleichzeitig lies die erstellte Signalsequenzbibliothek Optimierungsmöglichkeiten zu, durch die das Expressionssystem an die jeweils zu produzierende Hydrolase angepasst werden konnte.
Im nächsten Schritt wurde die Eignung des generierten Expressionssystems für die Erweiterung des Substratspektrums von G. oxydans untersucht. Durch die heterologe Produktion der E. coli-stämmigen Trehalase TreA mit PelB-Signalsequenz vermittelten Translokation in das Periplasma war es möglich, die Hydrolyse von Trehalose durch G. oxydans in vivo zu erreichen. Darüber hinaus zeigte sich, dass über die Regulation der Expressionsstärke von treA mit großer Wahrscheinlichkeit ein Mechanismus gegeben ist, durch den sich das Produktspektrum bei der Nutzung von Trehalose als Substrat stark beeinflussen lässt.
Im Hinblick auf die Erweiterung des Substratspektrums um Polysaccharide wurde in dieser Arbeit eine Strategie entwickelt, um die äußere Membran als Hindernis bei der Produktion von Exoenzymen zu überwinden und so den extrazellulären Abbau dieser Polymere zu gewährleisten. Diese Strategie basierte auf der Deletion von TolB, was eine Destabilisierung der äußeren Membran zur Folge hatte und in einem sekretorischen Stamm von G. oxydans resultierte. Bei diesem Stamm G. oxydans ΔtolB, welcher zusätzlich phoA exprimierte, konnten 49,6 ± 3 % der Gesamt-Aktivität des heterolog produzierten Reporterenzyms im Überstand detektiert werden. Im Fall des phoA exprimierenden Wildtyps hingegen wurden nur 2,6 % der PhoA-Aktivität extrazellulär nachgewiesen. Diese enorme Steigerung der sekretorischen Eigenschaften verdeutlichte das Potential des Stamms G. oxydans ΔtolB in Kombination mit dem generierten Expressionssystem für die Produktion und Translokation rekombinanter Enzyme im Hinblick auf die Nutzung von Disacchariden und Polysacchariden.
So konnte im Weiteren für den Stamm G. oxydans ΔtolB sacC eine Nutzung das nachhaltigen und günstigen Substrats Saccharose gezeigt werden. Zusätzlich besaß der Stamm die Fähigkeit, das Trisaccharid Raffinose als Substrat nutzen zu können, wobei eine Akkumulation der Feinchemikalie Melibiose im Kulturüberstand erfolgte.
Im Hinblick auf die Erweiterung des Substratspektrums von G. oxydans um Polysaccharide wurde sowohl mit Xylan als auch mit Cellulose als potentiellen nachhaltigen Substraten gearbeitet. Im Fall von Xylan konnte durch die Generierung des Stamms G. oxydans ΔtolB xynA eine Mutante entwickelt werden, welche zur Produktion der B. subtilis-stämmigen Endoxylanase XynA befähigt war. Dieses Enzym wurde mit großer Effizienz in der Überstand sekretiert und vermittelte dort die Hydrolyse von Xylan zu hauptsächlich Xylobiose. Diese präbiotisch aktive Verbindung konnte von G. oxydans nicht als Substrat genutzt werden und akkumulierte sich daher im Kulturüberstand. Somit war der Stamm G. oxydans ΔtolB xynA optimal für die effiziente Produktion von Xylooligosacchariden (XOs) geeignet.
Im Hinblick auf die vollständige Hydrolyse von Cellulose für die Produktion Glukose-basierter Feinchemikalien wie Glukonat und Ketoglukonat, konnte durch die Mutante G. oxydans ΔtolB boGH3A ein Stamm generiert werden, der zur Hydrolyse von Cellooligosacchariden befähigt war.
In einem weiteren Projekt dieser Arbeit wurde eine Charakterisierung der putativen β-Galaktosidasen Amuc_0771, Amuc_0824, Amuc_1666 und Amuc_1686 aus dem Darmbakterium Akkermansia muciniphila durchgeführt. Besonders Amuc_1686 stellte hierbei einen außergewöhnlichen Vertreter dieser Enzymklasse dar. Dieses Enzym wies starke Homologien mit eukaryotischen Proteinen auf, was auf einen erfolgten horizontalen Gentransfer hindeuten könnte. Darüber hinaus besitzt Amuc_1686 eine einzigartige C-terminale Discoidin-Domäne. Diese Domäne vermittelt eine nicht-kompetitive Hemmung des Enzyms durch verschiedenen Phospholipide und könnte einen direkten Hinweis auf einen Regulationsmechanismus innerhalb der mutualistischen Beziehung zwischen A. muciniphila und dem Wirtsorganismus liefern.
Der erste Schritt bei der Entwicklung eines geeigneten Expressionssystems war dabei die Identifikation von Sec-abhängigen Signalsequenzen, durch die eine effiziente Translokation der heterolog produzierten Hydrolasen vermittelt werden sollte. Mittels des Reporterenzyms PhoA konnte die Translokationseffizienz der verschiedenen Signalpeptide in G. oxydans quantifiziert und das effizientestes Signalpeptid identifiziert werden. Gleichzeitig lies die erstellte Signalsequenzbibliothek Optimierungsmöglichkeiten zu, durch die das Expressionssystem an die jeweils zu produzierende Hydrolase angepasst werden konnte.
Im nächsten Schritt wurde die Eignung des generierten Expressionssystems für die Erweiterung des Substratspektrums von G. oxydans untersucht. Durch die heterologe Produktion der E. coli-stämmigen Trehalase TreA mit PelB-Signalsequenz vermittelten Translokation in das Periplasma war es möglich, die Hydrolyse von Trehalose durch G. oxydans in vivo zu erreichen. Darüber hinaus zeigte sich, dass über die Regulation der Expressionsstärke von treA mit großer Wahrscheinlichkeit ein Mechanismus gegeben ist, durch den sich das Produktspektrum bei der Nutzung von Trehalose als Substrat stark beeinflussen lässt.
Im Hinblick auf die Erweiterung des Substratspektrums um Polysaccharide wurde in dieser Arbeit eine Strategie entwickelt, um die äußere Membran als Hindernis bei der Produktion von Exoenzymen zu überwinden und so den extrazellulären Abbau dieser Polymere zu gewährleisten. Diese Strategie basierte auf der Deletion von TolB, was eine Destabilisierung der äußeren Membran zur Folge hatte und in einem sekretorischen Stamm von G. oxydans resultierte. Bei diesem Stamm G. oxydans ΔtolB, welcher zusätzlich phoA exprimierte, konnten 49,6 ± 3 % der Gesamt-Aktivität des heterolog produzierten Reporterenzyms im Überstand detektiert werden. Im Fall des phoA exprimierenden Wildtyps hingegen wurden nur 2,6 % der PhoA-Aktivität extrazellulär nachgewiesen. Diese enorme Steigerung der sekretorischen Eigenschaften verdeutlichte das Potential des Stamms G. oxydans ΔtolB in Kombination mit dem generierten Expressionssystem für die Produktion und Translokation rekombinanter Enzyme im Hinblick auf die Nutzung von Disacchariden und Polysacchariden.
So konnte im Weiteren für den Stamm G. oxydans ΔtolB sacC eine Nutzung das nachhaltigen und günstigen Substrats Saccharose gezeigt werden. Zusätzlich besaß der Stamm die Fähigkeit, das Trisaccharid Raffinose als Substrat nutzen zu können, wobei eine Akkumulation der Feinchemikalie Melibiose im Kulturüberstand erfolgte.
Im Hinblick auf die Erweiterung des Substratspektrums von G. oxydans um Polysaccharide wurde sowohl mit Xylan als auch mit Cellulose als potentiellen nachhaltigen Substraten gearbeitet. Im Fall von Xylan konnte durch die Generierung des Stamms G. oxydans ΔtolB xynA eine Mutante entwickelt werden, welche zur Produktion der B. subtilis-stämmigen Endoxylanase XynA befähigt war. Dieses Enzym wurde mit großer Effizienz in der Überstand sekretiert und vermittelte dort die Hydrolyse von Xylan zu hauptsächlich Xylobiose. Diese präbiotisch aktive Verbindung konnte von G. oxydans nicht als Substrat genutzt werden und akkumulierte sich daher im Kulturüberstand. Somit war der Stamm G. oxydans ΔtolB xynA optimal für die effiziente Produktion von Xylooligosacchariden (XOs) geeignet.
Im Hinblick auf die vollständige Hydrolyse von Cellulose für die Produktion Glukose-basierter Feinchemikalien wie Glukonat und Ketoglukonat, konnte durch die Mutante G. oxydans ΔtolB boGH3A ein Stamm generiert werden, der zur Hydrolyse von Cellooligosacchariden befähigt war.
In einem weiteren Projekt dieser Arbeit wurde eine Charakterisierung der putativen β-Galaktosidasen Amuc_0771, Amuc_0824, Amuc_1666 und Amuc_1686 aus dem Darmbakterium Akkermansia muciniphila durchgeführt. Besonders Amuc_1686 stellte hierbei einen außergewöhnlichen Vertreter dieser Enzymklasse dar. Dieses Enzym wies starke Homologien mit eukaryotischen Proteinen auf, was auf einen erfolgten horizontalen Gentransfer hindeuten könnte. Darüber hinaus besitzt Amuc_1686 eine einzigartige C-terminale Discoidin-Domäne. Diese Domäne vermittelt eine nicht-kompetitive Hemmung des Enzyms durch verschiedenen Phospholipide und könnte einen direkten Hinweis auf einen Regulationsmechanismus innerhalb der mutualistischen Beziehung zwischen A. muciniphila und dem Wirtsorganismus liefern.
Schlagwörter
Gluconobacter oxydans, Disaccharide, Polysaccharide, Trehalose, Saccharose, Xylan, Cellulose, Signalpeptid, Sekretion, Exoenzym, Hydrolase, Zucker, Bioökonomie, nachwachsende Rohstoffe, Präbiotika, Probiotika, Darm, Mucin, Akkermansia muciniphila, Galaktosidase
Klassifikation (DDC)
570 Biowissenschaften, BiologieKosciow, Konrad: Untersuchungen zur Erweiterung des Substratspektrums von Gluconobacter oxydans. - Bonn, 2018. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5n-49451
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5n-49451
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Der erste Schritt bei der Entwicklung eines geeigneten Expressionssystems war dabei die Identifikation von Sec-abhängigen Signalsequenzen, durch die eine effiziente Translokation der heterolog produzierten Hydrolasen vermittelt werden sollte. Mittels des Reporterenzyms PhoA konnte die Translokationseffizienz der verschiedenen Signalpeptide in G. oxydans quantifiziert und das effizientestes Signalpeptid identifiziert werden. Gleichzeitig lies die erstellte Signalsequenzbibliothek Optimierungsmöglichkeiten zu, durch die das Expressionssystem an die jeweils zu produzierende Hydrolase angepasst werden konnte.
Im nächsten Schritt wurde die Eignung des generierten Expressionssystems für die Erweiterung des Substratspektrums von G. oxydans untersucht. Durch die heterologe Produktion der E. coli-stämmigen Trehalase TreA mit PelB-Signalsequenz vermittelten Translokation in das Periplasma war es möglich, die Hydrolyse von Trehalose durch G. oxydans in vivo zu erreichen. Darüber hinaus zeigte sich, dass über die Regulation der Expressionsstärke von treA mit großer Wahrscheinlichkeit ein Mechanismus gegeben ist, durch den sich das Produktspektrum bei der Nutzung von Trehalose als Substrat stark beeinflussen lässt.
Im Hinblick auf die Erweiterung des Substratspektrums um Polysaccharide wurde in dieser Arbeit eine Strategie entwickelt, um die äußere Membran als Hindernis bei der Produktion von Exoenzymen zu überwinden und so den extrazellulären Abbau dieser Polymere zu gewährleisten. Diese Strategie basierte auf der Deletion von TolB, was eine Destabilisierung der äußeren Membran zur Folge hatte und in einem sekretorischen Stamm von G. oxydans resultierte. Bei diesem Stamm G. oxydans ΔtolB, welcher zusätzlich phoA exprimierte, konnten 49,6 ± 3 % der Gesamt-Aktivität des heterolog produzierten Reporterenzyms im Überstand detektiert werden. Im Fall des phoA exprimierenden Wildtyps hingegen wurden nur 2,6 % der PhoA-Aktivität extrazellulär nachgewiesen. Diese enorme Steigerung der sekretorischen Eigenschaften verdeutlichte das Potential des Stamms G. oxydans ΔtolB in Kombination mit dem generierten Expressionssystem für die Produktion und Translokation rekombinanter Enzyme im Hinblick auf die Nutzung von Disacchariden und Polysacchariden.
So konnte im Weiteren für den Stamm G. oxydans ΔtolB sacC eine Nutzung das nachhaltigen und günstigen Substrats Saccharose gezeigt werden. Zusätzlich besaß der Stamm die Fähigkeit, das Trisaccharid Raffinose als Substrat nutzen zu können, wobei eine Akkumulation der Feinchemikalie Melibiose im Kulturüberstand erfolgte.
Im Hinblick auf die Erweiterung des Substratspektrums von G. oxydans um Polysaccharide wurde sowohl mit Xylan als auch mit Cellulose als potentiellen nachhaltigen Substraten gearbeitet. Im Fall von Xylan konnte durch die Generierung des Stamms G. oxydans ΔtolB xynA eine Mutante entwickelt werden, welche zur Produktion der B. subtilis-stämmigen Endoxylanase XynA befähigt war. Dieses Enzym wurde mit großer Effizienz in der Überstand sekretiert und vermittelte dort die Hydrolyse von Xylan zu hauptsächlich Xylobiose. Diese präbiotisch aktive Verbindung konnte von G. oxydans nicht als Substrat genutzt werden und akkumulierte sich daher im Kulturüberstand. Somit war der Stamm G. oxydans ΔtolB xynA optimal für die effiziente Produktion von Xylooligosacchariden (XOs) geeignet.
Im Hinblick auf die vollständige Hydrolyse von Cellulose für die Produktion Glukose-basierter Feinchemikalien wie Glukonat und Ketoglukonat, konnte durch die Mutante G. oxydans ΔtolB boGH3A ein Stamm generiert werden, der zur Hydrolyse von Cellooligosacchariden befähigt war.
In einem weiteren Projekt dieser Arbeit wurde eine Charakterisierung der putativen β-Galaktosidasen Amuc_0771, Amuc_0824, Amuc_1666 und Amuc_1686 aus dem Darmbakterium Akkermansia muciniphila durchgeführt. Besonders Amuc_1686 stellte hierbei einen außergewöhnlichen Vertreter dieser Enzymklasse dar. Dieses Enzym wies starke Homologien mit eukaryotischen Proteinen auf, was auf einen erfolgten horizontalen Gentransfer hindeuten könnte. Darüber hinaus besitzt Amuc_1686 eine einzigartige C-terminale Discoidin-Domäne. Diese Domäne vermittelt eine nicht-kompetitive Hemmung des Enzyms durch verschiedenen Phospholipide und könnte einen direkten Hinweis auf einen Regulationsmechanismus innerhalb der mutualistischen Beziehung zwischen A. muciniphila und dem Wirtsorganismus liefern.},
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Der erste Schritt bei der Entwicklung eines geeigneten Expressionssystems war dabei die Identifikation von Sec-abhängigen Signalsequenzen, durch die eine effiziente Translokation der heterolog produzierten Hydrolasen vermittelt werden sollte. Mittels des Reporterenzyms PhoA konnte die Translokationseffizienz der verschiedenen Signalpeptide in G. oxydans quantifiziert und das effizientestes Signalpeptid identifiziert werden. Gleichzeitig lies die erstellte Signalsequenzbibliothek Optimierungsmöglichkeiten zu, durch die das Expressionssystem an die jeweils zu produzierende Hydrolase angepasst werden konnte.
Im nächsten Schritt wurde die Eignung des generierten Expressionssystems für die Erweiterung des Substratspektrums von G. oxydans untersucht. Durch die heterologe Produktion der E. coli-stämmigen Trehalase TreA mit PelB-Signalsequenz vermittelten Translokation in das Periplasma war es möglich, die Hydrolyse von Trehalose durch G. oxydans in vivo zu erreichen. Darüber hinaus zeigte sich, dass über die Regulation der Expressionsstärke von treA mit großer Wahrscheinlichkeit ein Mechanismus gegeben ist, durch den sich das Produktspektrum bei der Nutzung von Trehalose als Substrat stark beeinflussen lässt.
Im Hinblick auf die Erweiterung des Substratspektrums um Polysaccharide wurde in dieser Arbeit eine Strategie entwickelt, um die äußere Membran als Hindernis bei der Produktion von Exoenzymen zu überwinden und so den extrazellulären Abbau dieser Polymere zu gewährleisten. Diese Strategie basierte auf der Deletion von TolB, was eine Destabilisierung der äußeren Membran zur Folge hatte und in einem sekretorischen Stamm von G. oxydans resultierte. Bei diesem Stamm G. oxydans ΔtolB, welcher zusätzlich phoA exprimierte, konnten 49,6 ± 3 % der Gesamt-Aktivität des heterolog produzierten Reporterenzyms im Überstand detektiert werden. Im Fall des phoA exprimierenden Wildtyps hingegen wurden nur 2,6 % der PhoA-Aktivität extrazellulär nachgewiesen. Diese enorme Steigerung der sekretorischen Eigenschaften verdeutlichte das Potential des Stamms G. oxydans ΔtolB in Kombination mit dem generierten Expressionssystem für die Produktion und Translokation rekombinanter Enzyme im Hinblick auf die Nutzung von Disacchariden und Polysacchariden.
So konnte im Weiteren für den Stamm G. oxydans ΔtolB sacC eine Nutzung das nachhaltigen und günstigen Substrats Saccharose gezeigt werden. Zusätzlich besaß der Stamm die Fähigkeit, das Trisaccharid Raffinose als Substrat nutzen zu können, wobei eine Akkumulation der Feinchemikalie Melibiose im Kulturüberstand erfolgte.
Im Hinblick auf die Erweiterung des Substratspektrums von G. oxydans um Polysaccharide wurde sowohl mit Xylan als auch mit Cellulose als potentiellen nachhaltigen Substraten gearbeitet. Im Fall von Xylan konnte durch die Generierung des Stamms G. oxydans ΔtolB xynA eine Mutante entwickelt werden, welche zur Produktion der B. subtilis-stämmigen Endoxylanase XynA befähigt war. Dieses Enzym wurde mit großer Effizienz in der Überstand sekretiert und vermittelte dort die Hydrolyse von Xylan zu hauptsächlich Xylobiose. Diese präbiotisch aktive Verbindung konnte von G. oxydans nicht als Substrat genutzt werden und akkumulierte sich daher im Kulturüberstand. Somit war der Stamm G. oxydans ΔtolB xynA optimal für die effiziente Produktion von Xylooligosacchariden (XOs) geeignet.
Im Hinblick auf die vollständige Hydrolyse von Cellulose für die Produktion Glukose-basierter Feinchemikalien wie Glukonat und Ketoglukonat, konnte durch die Mutante G. oxydans ΔtolB boGH3A ein Stamm generiert werden, der zur Hydrolyse von Cellooligosacchariden befähigt war.
In einem weiteren Projekt dieser Arbeit wurde eine Charakterisierung der putativen β-Galaktosidasen Amuc_0771, Amuc_0824, Amuc_1666 und Amuc_1686 aus dem Darmbakterium Akkermansia muciniphila durchgeführt. Besonders Amuc_1686 stellte hierbei einen außergewöhnlichen Vertreter dieser Enzymklasse dar. Dieses Enzym wies starke Homologien mit eukaryotischen Proteinen auf, was auf einen erfolgten horizontalen Gentransfer hindeuten könnte. Darüber hinaus besitzt Amuc_1686 eine einzigartige C-terminale Discoidin-Domäne. Diese Domäne vermittelt eine nicht-kompetitive Hemmung des Enzyms durch verschiedenen Phospholipide und könnte einen direkten Hinweis auf einen Regulationsmechanismus innerhalb der mutualistischen Beziehung zwischen A. muciniphila und dem Wirtsorganismus liefern.},
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