Fast detection of protein-protein interactions with an automated FRET-based system on the flow cytometer

Abstract

Although protein-protein interactions play a major role in almost all biological functions, those interactions cannot easily be analysed, especially not on single cell level and with regard to dynamic changes in protein arrangement. Conventional investigation methods, like the yeast two-hybrid system are highly time consuming. Förster resonance energy transfer (FRET) is commonly used to identify protein-protein interactions via confocal microscopy. However, this requires expert knowledge and produces high amounts of data.<br /> In order to overcome those limitations, a program was developed that automatically measures and calculates the FRET efficiency on cell by cell basis on the MACSQuant flow cytometer. Changes in protein-protein interactions can be assessed via relative signal changes of the donor and acceptor fluorochromes, causing a change in FRET efficiency. This allows for the identification of protein-protein interactions on large cell numbers in a minimum of time, in high throughput screenings and is easy to use.<br /> In this study, it could shown that interaction of the CD3 and CD4 coreceptors can be measured on the T cell’s surface after activation via an increase in FRET efficiency. Furthermore, also the homoclustering of the CD3 coreceptor could be detected using the automatic FRET measurement. Even when the FRET fluorochrome pair was changed, the results were highly comparable. For this experiment, the increase in FRET efficiency was even faster than the increase in intracellular calcium that is used as the standard activation marker. For that reason, this automatic assay had been used to test blood samples of patients that are suffering from severe immunodeficiencies and are compromised for different reasons in their ability of CD3 clustering. Indeed, here no increase in FRET efficiency could be measured compared to healthy blood donors. Therefore, the automatic FRET program can easily be used in clinical settings for the determination of certain immunodeficiencies in patients.<br /> Moreover, using the CD3 homoclustering FRET essay, the impact on lipid raft integrity on the clustering of CD3 could be detected. If the lipid rafts were manipulated, the CD3 receptor could not cluster effectively after T cell stimulation, leading to a decreased FRET efficiency compared to untreated T cells.<br /> The automatic FRET assay could also be used to determine the checkpoint inhibition in T cells. For that purpose, the interaction of CD3 and the PD-1 receptor was measured after a prolonged T cell stimulation leading to an increased FRET efficiency. That increase could be inhibited by applying blocking antibodies that are directed against the PD-1 ligands, prohibiting the co-stimulation that is essential for a successful immune escape. Therefore, this method is also a powerful tool allowing for high throughput screenings for pharmacologically active compounds.

Protein-Protein-Interaktionen spielen eine Schlüsselfunktion in fast allen biologischen Prozessen. Dennoch sind konventionelle Methoden, um diese Interaktionen nachzuweisen, wie beispielsweise das Hefe-Zwei-Hybrid System, üblicherweise sehr aufwendig und kompliziert. Häufig werden Protein-Protein-Interaktionen auch mithilfe des Förster Resonanz Energietransfers (FRET) vor allem bei der Konfokalmikoskopie gemessen. Diese Methode produziert allerdings riesige Datenmengen und verlangt dazu viel Fachwissen.<br /> Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde hier eine Methode entwickelt, mit der sich Protein-Protein-Interaktionen automatisch und auf Einzelzellbasis mit Hilfe der Durchflusszytometrie am MACSQuant Durchflusszytometer nachweisen lassen, da hier die FRET-Effizienz automatisch berechnet wird. Änderungen im Status der Protein-Protein-Interaktionen werden durch relative Änderungen in der Intensität der FRET Donor- und Akzeptorfluorochrome erfasst, wodurch sich der Wert der FRET-Effizienz ändert. So können Protein-Protein-Interaktionen sehr einfach auch auf hohen Zellzahlen in äußerst geringer Zeit und in Hochdurchsatzscreenings gemessen werden.<br /> In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die CD3 und CD4 Korezeptoren auf der T Zell-Oberfläche nach der Aktivierung mit SEB interagieren. Hier stieg die FRET-Effizienz nach der T Zell Aktivierung deutlich an. Weiterhin konnte auch die Clusterbildung des CD3 Rezeptors durch das automatisierte Messen der FRET-Effizienz nachgewiesen werden. Auch wenn das FRET-Fluorochromenpaar gewechselt wurde, waren die Messergebnisse vergleichbar. Der Nachweis der T Zell Aktivierung gelang mit der FRET-Analyse sogar schneller als durch die Messung des Anstiegs an intrazellulären Kalziumionen als Standard-Aktivierungsmarker. Daher wurde auch getestet, ob auf Blutproben von immundefizienten Patienten, die in der Clusterbildung ihres CD3-Rezeptors aus verschiedenen Gründen eingeschränkt waren, diesen Defekt nachgewiesen werden konnte. Tatsächlich konnte hier im Vergleich zu gesunden Spendern kein Anstieg in der FRET-Effizienz nach T-Zell Aktivierung gemessen werden. Aus diesem Grund könnte die automatisierte FRET-Analyse auch im klinischen Alltag zum Nachweis von speziellen Immundefekten verwendet werden.<br /> Mit Hilfe der CD3-Clustering FRET-Analyse konnte außerdem den Einfluss der Integrität der Lipid Rafts auf das Clustervermögen des CD3 Korezeptors nachgewiesen werden. Wurden die Lipid Rafts mit Hilfe verschiedener Chemikalien modifiziert, nahm die FRET-Effizienz nach T Zell Aktivierung verglichen zu unbehandelten Zellen ab.<br /> Weiterhin konnten die automatisierte FRET Analyse auch genutzt werden, um Immun-Checkpoint-Inhibition auf T Zellen zu bestätigen. Dafür wurde mittels FRET die Interaktion der CD3 und PD-1 Rezeptoren nach einer längeren T Zell-Stimulation gemessen: hier stieg die FRET-Effizienz deutlich an. Dieser Anstieg konnte jedoch verhindert werden, indem blockierende Antikörper, die gegen die Liganden des PD-1-Rezeptors gerichtet sind, verwendet wurden. Diese Antikörper unterbinden die Kostimulation, die für die antigenpräsentierende Zelle essentiell ist, um sich der Erkennung des Immunsystems erfolgreich zu entziehen. Folglich ist die automatisierte FRET-Analyse auch eine leistungsstarke Methode, um im Hochdurchsatzverfahren nach pharmakologisch aktiven Wirkstoffen, die diese Checkpoint Inhibition unterbinden, zu screenen.