Dualsterische Liganden, allosterische Agonisten und ein allosterischer Förderer der Agonist-Bindung und -Funktion

Abstract

Dualsterische Hybridliganden, bestehend aus einem allosterischen und einem orthosterischen Baustein, die über eine Zwischenkette verbundenen sind, gelten als ideale Werkzeuge zur Entwicklung subtyp- und signalwegselektiver Liganden. Abhängig von den Bindungsneigungen der einzelnen Bausteine zu den für sie vorgesehenen Bindungsstellen, können diese Liganden entweder in einer dualsterischen oder in einer rein allosterischen Bindungsorientierung mit dem Rezeptorprotein interagieren. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals an muskarinischen hM1-Rezeptoren der dynamische Wechsel zwischen der dualsterischen und der rein allosterischen Bindungsorientierung dualsterischer Hybridliganden, als ein Werkzeug zum Design von neuen Partialagonisten identifiziert werden, die einen neuen Ansatz für die Entwicklung von Arzneistoffen zur Behandlung von M. Alzheimer bilden können. Für die Charakterisierung der unterschiedlichen Bindungsorientierungen der zu untersuchenden Hybridliganden konnten in der vorliegenden Arbeit erstmals zwei Gleichungen für die Datenanalyse Anwendung finden, die den Erkenntisrahmen ihrer Vorgängerversionen substanziell erweiterten. Die zusätzliche Einbeziehung funktioneller Daten führte zu der Entwicklung einer neuen globalen Datenanalysevariante auf Basis des „Operational model of agonism for dynamic ligands“ die es erlaubte, die bislang bei Einzelkurvenbetrachtung durch Überparametrisierung analytisch unzugängliche Parameter τmax und εmax zu bestimmen. Dieses Vorgehen ermöglichte es erstmalig, für die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Hybridliganden mit εmax*, den systemunabhängigen Transduktionskoeffizienten bei 100% dualsterischer Rezeptorbindung in Abwesenheit einer Rezeptorreserve zu bestimmen und deren signifikanten Unterschied als potentielle Erklärung für die, trotz signifikant unterschiedlicher aktiver dualsterischer Bindungsorientierung bei einem Hybridpaar auf allen untersuchten Signalwegen (mit Ausnahme des durch Gi Proteine vermittelten Signalweges), gleich ausgeprägten Maximaleffekte Emax zu erklären: eine höherer Wert für εmax* kompensiert die durch eine geringere dualsterische Bindungsorientierung induzierte geringere aktive Rezeptorfraktion (dualsterische Bindung). Die Wirksamkeitsbetrachtung dualsterischer Liganden kann zukünftig demnach neben Emax und Rpose nach den Befunden der vorliegenden Arbeit auch deren rezeptorvermittelte maximale intrinsische Aktivität εmax* einschließen. <br /> Um weitere Einblicke in das Bindungsverhalten und die Signalwegaktivierung der dualsterischen Hybridliganden dieser Arbeit zu erlangen, wurde erstmals der Einfluss unterschiedlicher Mutationen im Bereich der putativ allosterischen Bindungsstelle des humanen hM1-Rezeptors untersucht. Zudem sollte überprüft werden, ob die Hybridliganden eine Ligand-spezifische Bevorzugung eines speziellen Signalweges induzieren. Auf diese Weise konnten Einblicke darüber gewonnen werden, welche Aminosäuren möglicherweise an der ligandvermittelten Bindung unterschiedlicher G Proteine sowie der Ausbildung unterschiedlicher Rezeptorkonformationen beteiligt sind. <br /> Neben seiner Muttersubstanz BQCA konnte auch erstmalig für den allosterische Baustein UR-MD-5 (BQCAd) im Rahmen dieser Arbeit in Gleichgewichtsbindungsexperimenten an hM1-Rezeptoren eine positive Kooperativität mit dem Agonisten [3H]Iperoxo nachgewiesen werden. Das um sieben Kohlenstoffatome längere allosterische Fragment UR-MD-6 (BQCAd) zeigte unter identischen Bedingungen eine negative Kooperativität mit [3H]Iperoxo. Somit konnte nachgewiesen werden, dass allein die Verlängerung des Alkylsubstituenten einen Wechsel der allosterischen Modulationsrichtung der Agonistbindung von positiv (PAM) zu negativ (NAM) bewirken kann. Zusätzlich durchgeführte funktionelle Experimente zeigten, dass UR-MD-5 zwar als ein positiv allosterischer Modulator hinsichtlich der [3H]Iperoxo-Gleichgewichtsbindung, jedoch als ein „stiller“ allosterischer Modulator (SAM) hinsichtlich der durch Iperoxo induzierten Gq Protein-vermittelten und als ein positiv allosterischer Modulator hinsichtlich der durch Iperoxo induzierten Gs Protein-vermittelten Rezeptoraktivierung fungiert.<br /> Auf der Suche nach selektiven Aktivatoren muskarinischer M1-Rezeptoren, konnte in der Literatur bereits eine Reihe von Substanzen als „allosterische Agonisten“ identifiziert werden. Für einige der dort als „allosterische Agonisten“ am muskarinischen M1-Rezeptor identifizierte Liganden, darunter auch die Substanz TBPB, konnte hinsichtlich ihrer Bindungstopographie nicht ausgeschlossen werden, dass es sich um einen „bitopischen“ Bindungsmodus handelt. In kinetischen Experimenten zeigte das allosterische Fragment UR-MD-2 (TBPBd) die Fähigkeit, am Flp-hM1-Rezeptor die Dissoziation des Radioantagonisten [3H]NMS zu verzögern und lieferte damit einen Beleg für eine allosterische Rezeptorinteraktion innerhalb eines ternären Komplexes (hM1/UR-MD-2/NMS). In Gleichgewichtsbindungsexperimenten zeigte UR-MD-2 als TBPBd, anders als für die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten allosterischen Fragmente vom Typ BQCAd, eine formal vollständige Inhibition der spezifischen [3H]NMS-Bindung als Ausdruck einer stark negativen Kooperativität mit [3H]NMS oder aber einer Interaktion mit Bereichen der orthosterischen Bindungsstelle. Untersuchungen unterschiedlicher Mutationen im Bereich der putativ allosterischen Bindungsstelle zeigten weitere Besonderheiten hinsichtlich der Bindungseigenschaften von UR-MD-2 (TBPBd) und lieferten weitere Hinweise auf eine Interaktion sowohl mit der allosterischen als auch mit Bereichen der orthosterischen Bindungsstelle. <br /> Zusammenfassend ist es im Rahmen dieser Arbeit gelungen, viele verschiedenartige Mechanismen der Ligand-Rezeptor-Interaktion wesentlich zu erhellen bzw. aufzudecken, die sowohl bei der Entwicklung neuer dualsterischer Liganden, als auch allosterischer Modulatoren eine Rolle spielen können.