The role of guanine nucleotide exchange factors (GEFs) in EGF-receptor signalling

Abstract

The small GTPase Rab5 is a key regulator of early endosomal trafficking. It functions as a molecular switch that can be activated by guanine nucleotide exchange factors (GEFs) and inactivated via hydrolysis of GTP with the help of catalytic GTPase activating proteins (GAPs). GEFs mediate the exchange of GTPase-bound GDP for GTP. One of at least nine Rab5 GEFs, that have been identified until today, is Rin1. However, the differences in the exact roles of these GEFs are not completely understood. Rin1 is a multi-domain protein that has multiple signalling functions alongside the Rab5 activation. It is for example also involved in ABL kinase signalling, where it increases ABL activation. Rab5 over-activation has been reported to be involved in the genesis and progression of many different types of cancer and it could often be traced back to Rin1 over-expression. On the other hand Rin1 has been found to have a tumour repressive effect, mediated by its ABL kinase signalling function. <br /> This study aimed on the identification of a small molecule inhibitor of the Rin1-mediated Rab5 activation. Such a small molecule inhibitor could be used as a tool to unravel parts of the complex signalling networks around Rab5. Ideally the inhibitor should be specific for Rin1 over other GEFs and moreover not influence its ABL kinase signalling function. <br /> A high-throughput in vitro screening of more than 20 000 small molecules has been performed. The screening assay monitored the Rin1-catalyzed nucleotide exchange on Rab5a by the use of the fluorescently labelled GTP analogue Bodipy-TR-GTP. Amongst other primary hits the compound CG3 05 A02 was identified. During specificity and aggregation studies it turned out to be the most promising candidate. <br /> Characterization of CG3 05 A02 revealed that its inhibitory effect in the Bodipy-TR-GTP nucleotide exchange assay is specific for Rin1 and Rabex-5 on Rab5a over several other GEF/GTPase pairs. The IC50 values were in both cases found to be in the low micromolar range. Rin1 and Rabex-5 share the homologous catalytic Vps9 domain and the compound might also be able to inhibit other Vps9 domain-containing GEFs. The compound did not induce aggregation of Rin1 or Rab5a and had no unspecific off-target effects in an unrelated insulin receptor auto-phosphorylation assay. It moreover did not influence the interaction between Rin1 and ABL1, indicating no intramolecular domain-unspecific inhibition. Unfortunately a control experiment with radioactively labelled GTP showed no inhibitory effect of the comound. The inhibition therefore depends on the use of Bodipy-TR-GTP but unlikely originates from CG3 05 A02 binding to the GTP analogue. In this case it would have inhibited the Bodipy-TR-GTP nucleotide exchange assay when GEFs/GTPases other than Rin1/Rabex-5 and Rab5 were used. This label-dependence classifies the compound unsuitable for cellular or in vivo application.<br /> The actual target of CG3 05 A02 could not be finally addressed but Bodipy-TR-GTP binding to Rab5a in absence of a GEF was not influenced by the compound. This argues against GTP-competitive binding as the mechanism of inhibition. The compound potentially targets either directly the Vps9 domains of Rin1 and Rabex-5, areas adjacent to these, or the complex between the GEFs and Rab5. A mechanism based on steric hindrance involving the compound and the Bodipy-TR moiety of the GTP analogue was proposed as the mode of action.<br /> Identification of a binding site for CG3 05 A02 in ongoing crystallization approaches could provide a starting point for in silico screenings that can result in a second generation of inhibitors of the Rin1-mediated Rab5 activation.

<strong>Die Rolle der Guaninnukleotid-Austauschfaktoren (GEFs) im EGF-Rezeptor Signalweg : Die Suche nach einem niedermolekularen Inhibitor der Rin1-vermittelten Rab5 Aktivierung</strong><br /> Rab5 ist eine kleine GTPase, die maßgeblich an der Regulierung des Membrantransportes zu- und -an frühen Endosomen beteiligt ist. GTPasen sind molekulare Schalter, die durch Guaninnukleotid Austauschfaktoren (GEFs) aktiviert und durch die Hydrolyse von GTP mit Hilfe katalytischer GTPase aktivierender Proteinen (GAPs) inaktiviert werden. GEFs vermitteln den Austausch von GTPase-gebundenem GDP gegen freies GTP. Einer von mindestens neun bisher beschriebenen Rab5 GEFs ist Rin1. Die genauen Unterschiede in Funktion und Wirkungsweise der verschiedenen Rab5 GEFs sind derzeit noch nicht im Gesamten entschlüsselt. Rin1 ist ein Multidomänenprotein mit verschiedenen Funktionen in der intrazellulären Signaltransduktion. Neben der Aktivierung von Rab5 spielt Rin1 ebenfalls eine Rolle in ABL Kinasen Signalwegen. Hier verstärkt es die Aktivierung der ABL Kinasen. <br /> Rab5 Überaktivierung wurde mit verschiedenen Krebsarten in Zusammenhang gebracht. In den meisten Fällen kann diese Überaktivierung auf Rin1 Überexpression zurückgeführt werden. Rin1 verfügt jedoch auch über eine krebsunterdrückende Funktion, die im Zusammenhang mit seiner Interaktion mit ABL Kinasen steht.<br /> Diese Arbeit zielt auf die Identifikation eines niedermolekularen Inhibitors der Rin1-vermittelten Rab5 Aktivierung ab. Der Inhibitor könnte helfen, die komplexen Signalkaskaden, an denen Rab5 beteiligt ist, aufzuschlüsseln. Idealerweise wäre er spezifisch für Rin1 gegenüber anderen GEFs. Außerdem sollte er die Interaktion zwischen Rin1 und den ABL Kinasen nicht beeinflussen. <br /> Hierfür wurde ein in vitro Hochdurchsatzscreening mit über 20 000 potentiellen niedermolekularen Inhibitoren durchgeführt. Das Screeningexperiment überwachte den Rin1-vermittelten Austausch von GDP gegen das Fluoreszenzmarkierte GTP Analogon Bodipy-TR-GTP an Rab5. So wurde unter Anderem der niedermolekulare Inhibitor CG3 05 A02 identifiziert. Während Spezifitäts- und Aggregationsstudien stellte sich dieser als der vielversprechendste Kandidat heraus. <br /> Seine Charakterisierung ergab Spezifität für Rin1 und Rabex-5 an der GTPase Rab5a im Bodipy-TR-GTP Nukleotidaustauschexperiment. Verschiedene andere GEF/GTPase Paare wurden nicht beeinflusst, obwohl deren Austauschmechanismus dem von Rin1 und Rabex-5 an Rab5 ähnelt. Die IC50 Werte, die in den Austauschexperimenten mit Rin1 und Rabex-5 ermittelt wurden, liegen beide im niedrigen micromolaren Bereich. Beide GEFs verfügen über eine homologe katalytische Vps9 Domäne. Es kann derzeit nicht ausgeschlossen werden, dass CG3 05 A02 auch weitere Vps9 Domänen GEFs inhibiert. Der Inhibitor führte keine Aggregation von Rin1 oder Rab5 herbei und hatte auch keinen unspezifischen Effekt in einem unverwandten Insulinrezeptor Autophosphorylierungsexperiment. Außerdem beeinflusste er die Interaktion zwischen Rin1 und ABL1 nicht, was gegen eine intramolekulare, domänenunspezifische Inhibition sprach. <br /> Bedauerlicherweise zeigte ein weiteres Kontrollexperiment keine Inhibition des Rin1-vermittelten Nukleotidaustausches, wenn radioaktiv markiertes GTP verwendet wurde. Dieses Ergebnis sprach für eine Bodipy-TR-GTP-Abhängigkeit der Inhibition. Diese stammt wahrscheinlich nicht von einer Interaktion zwischen dem Inhibitor und dem GTP Analog her, denn in diesem Fall wäre die Inhibition in allen Bodipy-TR-GTP Nukleotidaustauschexperimenten aufgetreten, auch wenn andere GEFs und GTPasen getestet wurden. Aufgrund dieser Markierungsabhängigkeit ist der Inhibitor für die zelluläre und die in vivo Anwendung ungeeignet.<br /> An welches Protein CG3 05 A02 bindet konnte nicht final aufgeklärt werden. Das Beladen von Rab5a mit Bodipy-TR-GTP in Abwesenheit eines GEFs wurde von CG3 05 A02 nicht beeinflusst, was gegen einen GTP-kompetitiven Mechanismus der Inhibition spricht. Der Inhibitor bindet entweder an die Vps9 Domänen von Rin1 und Rabex-5, in der Nähe von diesen, oder an den Komplex zwischen den GEFs und Rab5. Aufgrund der Datenlage wurde ein auf sterischer Hinderung basierender Inhibitionsmechanismus vermutet, bei dem der Bodipy-TR-Rest und der an den Proteinkomplex gebundene Inhibitor sich behindern, sodass das Nukleotid nicht in die Bindungstasche gelangen kann. Das deutlich kleinere, radioaktiv markierte GTP ist von dieser Hinderung nicht betroffen. <br /> Kristallisation der Proteine im Komplex mit CG3 05 A02 könnte zur Identifizierung einer Bindestelle führen, die als Ausgangspunkt für zukünftige in silico Screenings dienen könnte. Aus einem derartigen Screening könnte dann eine zweite Generation von Inhibitoren der Rin1-vermittelten Rab5 Aktivierung hervorgehen.