Entwicklung, Charakterisierung, Analytik und Anwendung von Tracern und Tool-Verbindungen für Gq-Proteine

Abstract

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), die wichtige Arzneimittelziele sind, aktivieren intrazelluläre G-Proteine, die als Relais zur Steuerung intrazellulärer Signalwege dienen. Die Blockade von Gq-Proteinen könnte eine neue Strategie für die Behandlung komplexer Krankheiten wie Krebs, chronische Lungenerkrankungen und Störungen des Immunsystems sein. Gegenwärtig sind keine Werkzeuge oder Methoden verfügbar, um Gq-Proteine in ihrer nativen Konformation direkt zu markieren, was für eine Anzahl von biologischen und klinischen Anwendungen nützlich wäre. In der durchgeführten Arbeit wurden Gq-spezifische chemische Sonden durch Tritiierung der makrocyclischen Naturstoffe FR900359 (FR) und YM-254890 (YM) entwickelt, die zu wichtigen Werkzeugen für die Analyse von GPCR-Funktionen geworden sind. Die Tracer erlaubten uns, ihre direkten Wechselwirkungen mit Gq-Proteinen zu messen, Affinitäten von Gq-Inhibitoren zu bestimmen und Bindungskinetiken zu messen. Wir konnten zeigen, dass beide Tracer tatsächlich auffallend verschieden sind und extrem unterschiedliche Bindungskinetiken aufweisen, wobei die FR-abgeleitete Sonde eine extrem niedrige Dissoziation zeigt. Ein "Dübel-Effekt", der durch Computerstudien aufgrund lipophiler Griffe, die nur in FR, aber nicht in YM vorhanden sind, entdeckt wurde, liefert eine plausible molekulare Erklärung. Es wird erwartet, dass diese Unterschiede zu Disparitäten in den pharmakologischen Wirkungen von FR und YM führen. Unter Verwendung von CRISPR / Cas9 Gq-Knockout-Zellen, die mit den verschiedenen Gq-Subtypen transfiziert wurden, zeigten wir, dass FR und YM eine ähnlich hohe Affinität für Gq, G11, G14, aber nicht für G15 / 16 aufweisen. Die Tracer dienten dazu, Gq-Proteine in einer Vielzahl von Organen, Zellen und Geweben mit hoher Genauigkeit nachzuweisen und zu quantifizieren. Darüber hinaus haben wir Tests etabliert, die zur Entdeckung von kleinen Molekülen Gq-Protein-Inhibitoren geführt haben.

G protein-coupled receptors (GPCRs), which are major drug targets, activate intracellular G proteins, that act as relays to control intracellular signaling pathways. The blockade of Gq proteins may be a new strategy for the treatment of complex diseases, such as cancer, chronic pulmonary diseases, and disorders of the immune system. Currently, no tools or methods are available for directly labeling Gq proteins in their native conformation, which would be useful for a number of biological and clinical applications. In the present study we developed Gq-specific chemical probes by tritiation of the macrocyclic natural products FR900359 (FR) and YM-254890 (YM), which have become important tools for dissecting GPCR functions. The tracers allowed us to measure their direct interactions with Gq proteins, to determine affinities of Gq inhibitors, and to measure binding kinetics. We could show that both tracers are in fact strikingly different possessing extremely divergent binding kinetics, the FR-derived probe showing extremely low dissociation. A "dowel effect" discovered by computational studies due to lipophilic handles present only in FR, but not in YM, provides a plausible molecular explanation. These differences are anticipated to translate into disparity in the pharmacological actions of FR and YM. Using CRISPR/Cas9 Gq-knock-out cells transfected with the different Gq subtypes we showed that FR and YM display similarly high affinity for Gq, G11, G14, but not for G15/16. The tracers served to detect and quantify Gq proteins in a variety of organs, cells and tissues with high accuracy. Moreover, we established assays that have led to the discovery of small molecule Gq protein inhibitors.