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Funktionelle Charakterisierung eines spermienspezifischen Na+/H+-Austauschers

dc.contributor.advisorKaupp, Ulrich Benjamin
dc.contributor.authorWindler, Florian
dc.date.accessioned2020-04-25T14:16:33Z
dc.date.available2020-04-25T14:16:33Z
dc.date.issued14.12.2018
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/20.500.11811/7688
dc.description.abstractSekundär aktive Austauscher sind membranständige Proteine, die den elektrochemischen Gradienten eines Ions nutzen, um den Transport anderer Ionen oder Substrate über die Zellmembran zu ermöglichen. Natrium/Protonen (Na+/H+) Austauscher der Solute Carrier 9 (SLC9) Familie spielen dabei eine Rolle in einer Vielzahl von physiologischen Prozessen. Ein bis heute rätselhaftes Mitglied der SLC9 Familie ist der spermienspezifische Austauscher SLC9C1. Es ist bis heute nicht bekannt, ob SLC9C1 ein funktionstüchtiger Na+/H+ Austauscher ist. SLC9C1 besitzt eine einzigartige dreiteilige Struktur; eine Austauscher (NHE) Domäne, eine Spannungssensordomäne (VSD) sowie eine Bindestelle für zyklische Nukleotide (CNBD). VSDs und CNBDs sind funktionelle Proteindomänen, die man bereits in anderen Proteinen gefunden hat, VSDs überwiegend in Ionenkanälen, aber auch in einer spannungsabhängigen Phosphatase, CNBDs in Proteinkinasen, Transkriptionsfaktoren, und auch in Ionenkanälen. SLC9C1 ist das erste Mitglied der SLC Familie, in dem solche Proteindomänen gefunden wurden.
Im Rahmen meiner Arbeit habe ich diesen phylogenetischen Hybrid untersucht. Als Modellprotein diente dazu SLC9C1 des Seeigels Strongylocentrotus purpuratus (SpSLC9C1). Durch den Einsatz pH sensitiver Fluoreszenzfarbstoffe in der Elektrophysiologie konnte ich zeigen, dass SpSLC9C1 ein funktionstüchtiger Na+/H+ Austauscher ist. Hyperpolarisierende Spannungssprünge aktivieren sowohl Gating Ströme der VSD als auch den sekundär aktiven Na+/H+ Austausch. Ich konnte die Spannungsabhängigkeit der Austauschaktivität bestimmen, sowie zeigen, dass cAMP, aber nicht cGMP, die Spannungsabhängigkeit der Gating Ströme und der Austauschaktivität moduliert. Mutationen in der NHE Domäne, der CNBD und der VSD verhinderten jeweils den Na+/H+ Austausch bzw. die Modulation durch cAMP oder beeinflussten die Gating Ströme.
Ein Antikörper bestätigte die Expression von SLC9C1 in S. purpuratus Spermien. Mithilfe von spannungs , pH und Na+ sensitiven Fluoreszenzfarbstoffen in S. purpuratus Spermien konnte ich zeigen, dass SpSLC9C1 auch in Spermien durch Hyperpolarisation aktiviert wird. Der Na+/H+ Austausch alkalisiert das Flagellum nach der Lockstoffstimulation und ermöglicht dem Spermium die chemotaktische Navigation.
dc.description.abstractThe solute carrier SLC9C1 is a Na+/H+-exchanger gated by an S4-type voltage-sensor and cyclic-nucleotide binding
Secondary active exchangers are membrane bound proteins that use the electrochemical gradient of ions to transport other ions or substrates across cell membranes. Within these proteins, sodium/proton (Na+/H+) exchangers of the Solute Carrier 9 (SLC9) family play a crucial role in a number of physiological processes. A so far enigmatic member of this family is the sperm specific exchanger SLC9C1. No evidence exists up to today that SLC9C1 is a functional Na+/H+ exchanger. SLC9C1 features a unique tripartite structure; an exchanger (NHE) domain, a voltage sensing domain (VSD) as well as a cyclic nucleotide binding domain (CNBD). VSDs and CNBDs are protein domains that are found in a variety of proteins, VSDs mainly in ion channels but also in a voltage sensitive phosphatase, CNBDs in protein kinases, transcription factors and also ion channels. SLC9C1 is the first member of the SLC9 family in which these protein domains was found.
During my thesis, I investigated this phylogenetic hybrid. As a model protein, I chose SLC9C1 from the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus (SpSLC9C1). By using a pH sensitive fluorescence dye within an electrophysiological setup, I could show that SpSLC9C1 is indeed a functional Na+/H+ exchanger. Hyperpolarizing voltage steps evoked both gating currents and secondary active Na+/H+ exchange. I could determine the voltage dependence of exchanger activation. Furthermore, I looked into the action of cyclic nucleotides such as cGMP and cAMP on SpSLC9C1. Cyclic AMP, but not cGMP affected the voltage dependence of both gating currents and exchange activity. Mutations in the NHE domain, CNBD and VSD abolished Na+/H+ exchange, cAMP modulation or affected voltage gating, respectively.
An antibody was raised to confirm SLC9C1 expression in S. purpuratus sperm. By using voltage , pH and Na+ sensitive fluorescent dyes together with a rapid mixing device, I could show that SpSLC9C1 in sperm activates during hyperpolarization. The Na+/H+ exchange alkalizes the flagellum upon stimulation with the chemoattractant and allows chemotactic navigation.
dc.language.isodeu
dc.relation.ispartofseriescaesar ; 00033
dc.rightsIn Copyright
dc.rights.urihttp://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
dc.subjectNHE
dc.subjectSpannungssensor
dc.subjectSpermien
dc.subjectAustauscher
dc.subjectNukleotide
dc.subjectexchanger
dc.subjectVSD
dc.subjectCNBD
dc.subjectsperm
dc.subject.ddc570 Biowissenschaften, Biologie
dc.titleFunktionelle Charakterisierung eines spermienspezifischen Na+/H+-Austauschers
dc.typeDissertation oder Habilitation
dc.publisher.nameUniversitäts- und Landesbibliothek Bonn
dc.publisher.locationBonn
dc.rights.accessRightsopenAccess
dc.identifier.urnhttps://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5n-52986
ulbbn.pubtypeErstveröffentlichung
ulbbnediss.affiliation.nameRheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn
ulbbnediss.affiliation.locationBonn
ulbbnediss.thesis.levelDissertation
ulbbnediss.dissID5298
ulbbnediss.date.accepted24.10.2018
ulbbnediss.instituteAngegliederte Institute, verbundene wissenschaftliche Einrichtungen : Stiftung caesar
ulbbnediss.fakultaetMathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
dc.contributor.coRefereeKolanus, Waldemar


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