Ein neuer Weg der mikrobiellen Schwefeloxidation

Abstract

Heterodisulfidreduktase-Komplexe vom ABC-Typ koppeln in methanogenen Archaeen durch eine Flavin-basierte Elektronen-Bifurkation die endergone Reduktion von Ferredoxin mit der exergonen Reduktion von CoM-S-S-CoB. Hdr-ähnliche Komplexe mit einer potentiellen Involvierung in den mikrobiellen dissimilatorischen Schwefelmetabolismus sind in Desulfurikanten und Sulfurikanten bekannt. Basierend auf Transkriptom- und Proteom-Analysen wird postuliert, dass Hdr-ähnliche Systeme in Sulfurikanten eine Funktion im Rahmen der Oxidation reduzierter Schwefelverbindungen einnehmen und das Dsr-System funktionell ersetzen.<br /> In Ermangelung eines Modellorganismus konnte diese Hypothese bisher nicht experimentell bewiesen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Alphaproteobakterium<em> Hyphomicrobium denitrificans</em> X^T als Modellorganismus zur Untersuchung der Rolle Hdr-ähnlicher Systeme etabliert. Ein genetisches System erlaubt eine gerichtete Mutagenese des Genoms des Organismus einschließlich der Generierung von Deletionsmutanten und deren Komplementierung <em>in trans</em>. Im Gegensatz zu vorherigen Berichten konnte für <em>Hyphomicrobium</em> X ein oxidativer dissimilatorischer Schwefelmetabolismus mit organischen und anorganischen Substraten nachgewiesen werden. Immunologische, Genom- und Proteom-Analysen belegten die Beteiligung eines Hdr-ähnlichen Systems. Im Gegensatz zum Wildtyp konnte eine Deletionsmutante ohne funktionellen Hdr-ähnlichen Komplex nicht mehr mit Dimethylsulfid als Substrat wachsen. Während einer Co-Fermentation mit Methanol und Thiosulfat oxidierte die Mutante Thiosulfat nur unvollständig zu Tetrathionat und nicht vollständig zu Sulfat. Die Komplementierung <em>in trans</em> der Deletionsmutante mit einem kompletten hdr-ähnlichen Gencluster resultierte in einem wildtypischen Phänotyp und lieferte den erstmaligen genetischen Beweis für eine Beteiligung <em>Hdr</em>-ähnlicher Systeme an der Oxidation reduzierter Schwefelverbindungen.<br /> Eine Deletionsmutante für das im erweiterten <em>hdr</em>-ähnlichen Gencluster kodierte Lipoatbindeprotein LbpA glich in ihrem Phänotyp der<em> Δhdr</em>-Mutante und unterstützt damit die Theorie, dass LbpAs eine essentielle Rolle für die Funktion Hdr-ähnlicher Systeme in Sulfurikanten spielen. Damit konnte Liponsäure eine bisher unbekannte Funktion im oxidativen dissimilatorischen Schwefelstoffwechsel zugewiesen werden.<br /> Durch die heterologe Expression ganzer erweiterter <em>hdr</em>-ähnlicher Genloki wurde gezeigt, dass diese ein funktionelles Operon bilden. Mit HdrA aus <em>Hyphomicrobium</em> X konnte erstmalig eine Untereinheit eines <em>Hdr</em>-ähnlichen Systems mit ihren prosthetischen Gruppen rekombinant in <em>Escherichia coli </em>produziert, aufgereinigt und kristallisiert werden. Spektroskopische und kristallographische Analysen des Proteins zeigten, das HdrA einen Homodimer ausbildet, der pro Untereinheit jeweils ein 4Fe-4S-Cluster und ein FAD bindet. Für beide Cofaktoren konnten die jeweiligen Redoxpotentiale ermittelt werden. Sowohl die Kristallstruktur als auch durch UV/Vis-Spektroskopie unterstützte Redoxtitrationen des Eisen-Schwefel-Flavoproteins zeigten, dass der FAD-Cofaktor von HdrA ein stabiles Semichinon ausbildet. Damit ist es wahrscheinlich, dass HdrA in Sulfurikanten keine Elektronen-Bifurkation vollzieht.