Escherichia coli und Synechocystis sp. als heterologe Produktionssysteme für Ectoin und Hydroxyectoin
Escherichia coli und Synechocystis sp. als heterologe Produktionssysteme für Ectoin und Hydroxyectoin
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DissertationPrüfungsdatum
03.09.2018Datum der Veröffentlichung
15.02.2019Erstgutachter
Galinski, Erwin A.Zweitgutachter
Deppenmeier, UweMetadaten
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Inhalt
Die kompatiblen Solute Ectoin und Hydroxyectoin werden von vielen Mikroorganismen zur Anpassung an osmotischen Stress synthetisiert. Darüber hinaus haben sie eine protektive Wirkung auf Biomoleküle, Zellen und Gewebe gegenüber verschiedenen Stressfaktoren und sind daher für biotechnologische Anwendungen interessant. In dieser Arbeit wurde die Biosynthese der Ectoine sowohl in dem natürlichen Produzenten Acidiphilium cryptum als auch in Escherichia coli und Synechocystis sp., die als heterologe Produktionssysteme dienten, untersucht. Schwerpunkt war die Produktion bei geringer Salinität, um den bisherigen Produktionsprozess mit Halomonas elongata zu optimieren, der durch einen erhöhten NaCl-Bedarf und eine aufwendige Trennung der Ectoine kostenintensiv ist.
Im Vergleich zu anderen Bakterien hat A. cryptum eine geringe NaCl-Toleranz (≤ 5 %), aber eine hohe Toleranz gegenüber Aluminiumsulfat (> 300 mM). Weiterhin ergaben HPLC- und NMR-Analysen, dass A. cryptum hauptsächlich Hydroxyectoin und Trehalose als Antwort auf osmotischen Stress synthetisiert. Ein bioinformatischer Vergleich zeigte, dass sich die Ectoinsynthase (EctC) von A. cryptum durch eine geringe Acidität deutlich von EctC halophiler Bakterien unterscheidet. Dies stimmt mit Enzymtests überein, die eine Abnahme der Aktivität mit steigender NaCl-Konzentration ergaben. Insgesamt lassen die Ergebnisse darauf schließen, dass das ectABCDask-Gencluster von A. cryptum ein geeigneter Kandidat für eine salzfreie Produktion der Ectoine in E. coli ist.
Weiterhin wurde in dieser Arbeit die Produktion von Ectoin und Hydroxyectoin in E. coli DH5α unter Verwendung des ectABCDask-Genclusters aus A. cryptum näher charakterisiert und optimiert. Das Produktionssystem basiert auf dem Vektor pASK-IBA3 mit dem durch Anhydrotetracyclin induzierbaren tet-Promotor und erlaubt eine hohe Produktion sowie extrazelluläre Akkumulation der Solute. Physiologische Untersuchungen ergaben, dass die höchste Ausbeute an Ectoin bzw. Hydroxyectoin bei Wachstum mit Glycerin und wenig NaCl (0,25 - 0,5 %) erreicht wird. Die Wachstumsrate war zwar geringer als bei Anzucht mit Glucose und anderen Kohlenstoffquellen, aber dafür wurde Kohlenstoff vermehrt in die Produktion der Ectoine statt der Biomasse gelenkt.
Mit dem optimierten Ectoin- und Hydroxyectoin-Produzenten konnte ein hoher extrazellulärer Solutgehalt von 2,9 bzw. 2,2 g/g Trockenbiomasse (TBM) im Schüttelkolben erzielt werden. Weiterhin ergab sich eine maximale spezifische Produktivität von bis zu 353 mg/(g TBM x h), die deutlich höher ist als bei den bisher in der Literatur beschriebenen Produktionsstämmen. Insgesamt zeichnet sich das Produktionssystem dadurch aus, dass entweder Ectoin oder Hydroxyectoin mit einer hohen spezifischen Produktivität in Minimalmedium mit wenig NaCl (≤ 0,5 %) produziert werden kann. Außerdem werden die produzierten Ectoine überwiegend im Medium akkumuliert (≥ 99 %) und der Anteil unerwünschter Nebenprodukte ist minimal (≤ 4 %). Aufgrund dessen könnte das Produktionssystem maßgeblich zur Optimierung des derzeitigen industriellen Produktions- und Gewinnungsprozesses beitragen.
Außerdem wurde mit den Ergebnissen dieser Arbeit eine Basis geschaffen, um die heterologe Produktion der Ectoine ausgehend von CO2 und Licht mit Hilfe des Cyanobakteriums Synechocystis voranzutreiben. Hydroxyectoin konnte erstmals unter phototrophen Bedingungen in Synechocystis mit dem ectABCD-Gencluster von Pseudomonas stutzeri produziert werden. Mittels HPLC ergab sich ein intrazellulärer und extrazellulärer Solutgehalt von bis zu 25,2 bzw. 112,5 mg/g TBM bei Wachstum ohne NaCl.
Im Vergleich zu anderen Bakterien hat A. cryptum eine geringe NaCl-Toleranz (≤ 5 %), aber eine hohe Toleranz gegenüber Aluminiumsulfat (> 300 mM). Weiterhin ergaben HPLC- und NMR-Analysen, dass A. cryptum hauptsächlich Hydroxyectoin und Trehalose als Antwort auf osmotischen Stress synthetisiert. Ein bioinformatischer Vergleich zeigte, dass sich die Ectoinsynthase (EctC) von A. cryptum durch eine geringe Acidität deutlich von EctC halophiler Bakterien unterscheidet. Dies stimmt mit Enzymtests überein, die eine Abnahme der Aktivität mit steigender NaCl-Konzentration ergaben. Insgesamt lassen die Ergebnisse darauf schließen, dass das ectABCDask-Gencluster von A. cryptum ein geeigneter Kandidat für eine salzfreie Produktion der Ectoine in E. coli ist.
Weiterhin wurde in dieser Arbeit die Produktion von Ectoin und Hydroxyectoin in E. coli DH5α unter Verwendung des ectABCDask-Genclusters aus A. cryptum näher charakterisiert und optimiert. Das Produktionssystem basiert auf dem Vektor pASK-IBA3 mit dem durch Anhydrotetracyclin induzierbaren tet-Promotor und erlaubt eine hohe Produktion sowie extrazelluläre Akkumulation der Solute. Physiologische Untersuchungen ergaben, dass die höchste Ausbeute an Ectoin bzw. Hydroxyectoin bei Wachstum mit Glycerin und wenig NaCl (0,25 - 0,5 %) erreicht wird. Die Wachstumsrate war zwar geringer als bei Anzucht mit Glucose und anderen Kohlenstoffquellen, aber dafür wurde Kohlenstoff vermehrt in die Produktion der Ectoine statt der Biomasse gelenkt.
Mit dem optimierten Ectoin- und Hydroxyectoin-Produzenten konnte ein hoher extrazellulärer Solutgehalt von 2,9 bzw. 2,2 g/g Trockenbiomasse (TBM) im Schüttelkolben erzielt werden. Weiterhin ergab sich eine maximale spezifische Produktivität von bis zu 353 mg/(g TBM x h), die deutlich höher ist als bei den bisher in der Literatur beschriebenen Produktionsstämmen. Insgesamt zeichnet sich das Produktionssystem dadurch aus, dass entweder Ectoin oder Hydroxyectoin mit einer hohen spezifischen Produktivität in Minimalmedium mit wenig NaCl (≤ 0,5 %) produziert werden kann. Außerdem werden die produzierten Ectoine überwiegend im Medium akkumuliert (≥ 99 %) und der Anteil unerwünschter Nebenprodukte ist minimal (≤ 4 %). Aufgrund dessen könnte das Produktionssystem maßgeblich zur Optimierung des derzeitigen industriellen Produktions- und Gewinnungsprozesses beitragen.
Außerdem wurde mit den Ergebnissen dieser Arbeit eine Basis geschaffen, um die heterologe Produktion der Ectoine ausgehend von CO2 und Licht mit Hilfe des Cyanobakteriums Synechocystis voranzutreiben. Hydroxyectoin konnte erstmals unter phototrophen Bedingungen in Synechocystis mit dem ectABCD-Gencluster von Pseudomonas stutzeri produziert werden. Mittels HPLC ergab sich ein intrazellulärer und extrazellulärer Solutgehalt von bis zu 25,2 bzw. 112,5 mg/g TBM bei Wachstum ohne NaCl.
Schlagwörter
kompatible Solute, Ectoin, Hydroxyectoin, osmotische Anpassung, Acidiphilium cryptum, heterologe Expression, Escherichia coli, Synechocystis, sp. PCC 6803
Klassifikation (DDC)
570 Biowissenschaften, BiologieMoritz, Katharina: Escherichia coli und Synechocystis sp. als heterologe Produktionssysteme für Ectoin und Hydroxyectoin. - Bonn, 2019. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5n-53365
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5n-53365
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author = {{Katharina Moritz}},
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Im Vergleich zu anderen Bakterien hat A. cryptum eine geringe NaCl-Toleranz (≤ 5 %), aber eine hohe Toleranz gegenüber Aluminiumsulfat (> 300 mM). Weiterhin ergaben HPLC- und NMR-Analysen, dass A. cryptum hauptsächlich Hydroxyectoin und Trehalose als Antwort auf osmotischen Stress synthetisiert. Ein bioinformatischer Vergleich zeigte, dass sich die Ectoinsynthase (EctC) von A. cryptum durch eine geringe Acidität deutlich von EctC halophiler Bakterien unterscheidet. Dies stimmt mit Enzymtests überein, die eine Abnahme der Aktivität mit steigender NaCl-Konzentration ergaben. Insgesamt lassen die Ergebnisse darauf schließen, dass das ectABCDask-Gencluster von A. cryptum ein geeigneter Kandidat für eine salzfreie Produktion der Ectoine in E. coli ist.
Weiterhin wurde in dieser Arbeit die Produktion von Ectoin und Hydroxyectoin in E. coli DH5α unter Verwendung des ectABCDask-Genclusters aus A. cryptum näher charakterisiert und optimiert. Das Produktionssystem basiert auf dem Vektor pASK-IBA3 mit dem durch Anhydrotetracyclin induzierbaren tet-Promotor und erlaubt eine hohe Produktion sowie extrazelluläre Akkumulation der Solute. Physiologische Untersuchungen ergaben, dass die höchste Ausbeute an Ectoin bzw. Hydroxyectoin bei Wachstum mit Glycerin und wenig NaCl (0,25 - 0,5 %) erreicht wird. Die Wachstumsrate war zwar geringer als bei Anzucht mit Glucose und anderen Kohlenstoffquellen, aber dafür wurde Kohlenstoff vermehrt in die Produktion der Ectoine statt der Biomasse gelenkt.
Mit dem optimierten Ectoin- und Hydroxyectoin-Produzenten konnte ein hoher extrazellulärer Solutgehalt von 2,9 bzw. 2,2 g/g Trockenbiomasse (TBM) im Schüttelkolben erzielt werden. Weiterhin ergab sich eine maximale spezifische Produktivität von bis zu 353 mg/(g TBM x h), die deutlich höher ist als bei den bisher in der Literatur beschriebenen Produktionsstämmen. Insgesamt zeichnet sich das Produktionssystem dadurch aus, dass entweder Ectoin oder Hydroxyectoin mit einer hohen spezifischen Produktivität in Minimalmedium mit wenig NaCl (≤ 0,5 %) produziert werden kann. Außerdem werden die produzierten Ectoine überwiegend im Medium akkumuliert (≥ 99 %) und der Anteil unerwünschter Nebenprodukte ist minimal (≤ 4 %). Aufgrund dessen könnte das Produktionssystem maßgeblich zur Optimierung des derzeitigen industriellen Produktions- und Gewinnungsprozesses beitragen.
Außerdem wurde mit den Ergebnissen dieser Arbeit eine Basis geschaffen, um die heterologe Produktion der Ectoine ausgehend von CO2 und Licht mit Hilfe des Cyanobakteriums Synechocystis voranzutreiben. Hydroxyectoin konnte erstmals unter phototrophen Bedingungen in Synechocystis mit dem ectABCD-Gencluster von Pseudomonas stutzeri produziert werden. Mittels HPLC ergab sich ein intrazellulärer und extrazellulärer Solutgehalt von bis zu 25,2 bzw. 112,5 mg/g TBM bei Wachstum ohne NaCl.},
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Im Vergleich zu anderen Bakterien hat A. cryptum eine geringe NaCl-Toleranz (≤ 5 %), aber eine hohe Toleranz gegenüber Aluminiumsulfat (> 300 mM). Weiterhin ergaben HPLC- und NMR-Analysen, dass A. cryptum hauptsächlich Hydroxyectoin und Trehalose als Antwort auf osmotischen Stress synthetisiert. Ein bioinformatischer Vergleich zeigte, dass sich die Ectoinsynthase (EctC) von A. cryptum durch eine geringe Acidität deutlich von EctC halophiler Bakterien unterscheidet. Dies stimmt mit Enzymtests überein, die eine Abnahme der Aktivität mit steigender NaCl-Konzentration ergaben. Insgesamt lassen die Ergebnisse darauf schließen, dass das ectABCDask-Gencluster von A. cryptum ein geeigneter Kandidat für eine salzfreie Produktion der Ectoine in E. coli ist.
Weiterhin wurde in dieser Arbeit die Produktion von Ectoin und Hydroxyectoin in E. coli DH5α unter Verwendung des ectABCDask-Genclusters aus A. cryptum näher charakterisiert und optimiert. Das Produktionssystem basiert auf dem Vektor pASK-IBA3 mit dem durch Anhydrotetracyclin induzierbaren tet-Promotor und erlaubt eine hohe Produktion sowie extrazelluläre Akkumulation der Solute. Physiologische Untersuchungen ergaben, dass die höchste Ausbeute an Ectoin bzw. Hydroxyectoin bei Wachstum mit Glycerin und wenig NaCl (0,25 - 0,5 %) erreicht wird. Die Wachstumsrate war zwar geringer als bei Anzucht mit Glucose und anderen Kohlenstoffquellen, aber dafür wurde Kohlenstoff vermehrt in die Produktion der Ectoine statt der Biomasse gelenkt.
Mit dem optimierten Ectoin- und Hydroxyectoin-Produzenten konnte ein hoher extrazellulärer Solutgehalt von 2,9 bzw. 2,2 g/g Trockenbiomasse (TBM) im Schüttelkolben erzielt werden. Weiterhin ergab sich eine maximale spezifische Produktivität von bis zu 353 mg/(g TBM x h), die deutlich höher ist als bei den bisher in der Literatur beschriebenen Produktionsstämmen. Insgesamt zeichnet sich das Produktionssystem dadurch aus, dass entweder Ectoin oder Hydroxyectoin mit einer hohen spezifischen Produktivität in Minimalmedium mit wenig NaCl (≤ 0,5 %) produziert werden kann. Außerdem werden die produzierten Ectoine überwiegend im Medium akkumuliert (≥ 99 %) und der Anteil unerwünschter Nebenprodukte ist minimal (≤ 4 %). Aufgrund dessen könnte das Produktionssystem maßgeblich zur Optimierung des derzeitigen industriellen Produktions- und Gewinnungsprozesses beitragen.
Außerdem wurde mit den Ergebnissen dieser Arbeit eine Basis geschaffen, um die heterologe Produktion der Ectoine ausgehend von CO2 und Licht mit Hilfe des Cyanobakteriums Synechocystis voranzutreiben. Hydroxyectoin konnte erstmals unter phototrophen Bedingungen in Synechocystis mit dem ectABCD-Gencluster von Pseudomonas stutzeri produziert werden. Mittels HPLC ergab sich ein intrazellulärer und extrazellulärer Solutgehalt von bis zu 25,2 bzw. 112,5 mg/g TBM bei Wachstum ohne NaCl.},
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