Charakterisierung des CPEB3 Ribozyms

Abstract

Kurze RNA Stränge mit enzymatischer Aktivität sind als Ribozyme bekannt. Das HDV-ähnliche CPEB3 Ribozym ist eine wenig erforschte selbstspaltende RNA. Es existiert in einer einzelnen hochkonservierten Kopie in der Sequenz des zweiten Introns im <i>cpeb3</i> Gen einer Vielzahl von Säugern. Das primäre Ziel dieser Dissertation war die Charakterisierung des CPEB3 Ribozyms mittels der Untersuchung des Spaltungsmechanismus und der Regulation. Die Ergebnisse sollen zukünftige Studien zur Rolle des CPEB3 Ribozyms in der Genregulation bei Säugern und im Menschen unterstützen. Bisher wurde das für die Spaltung essenzielle C₅₇ identifiziert. Höchstwahrscheinlich ist es an einem Säure-Base-Mechanismus mit C₅₇ als Säure und Mg²⁺ als Base beteiligt.<br /> Zwei Methoden sollten zur Charakterisierung der kinetischen Aktivität des CPEB3 Ribozyms eingesetzt werden. Das Ribozym sollte aus einem langen, Struktur-gebenden 5'-³²P-markierten Strang mit der Spaltungsposition und einem kurzen Strang mit dem C₅₇<i>in vitro</i> rekonstruiert werden. Diese Methode sollte in weiteren <i>in vitro</i> Studien eingesetzt werden. Das erstmals erfolgreich rekonstruierte CPEB3 Ribozym zeigte eine mit früheren Studien vergleichbare Aktivität. Die Untersuchung der pH-Abhängigkeit bot in der Auftragung der Spaltungsraten bei pH 5 - 9 einen Glocken-ähnlichen Kurvenverlauf, der auf zwei ionisierbare Gruppen hindeutete. Zur Untersuchung der Ionen-Promiskuität wurden die Metall-Ionen K⁺, Ba²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺, Mn²⁺ und Cu²⁺ getestet. Besonders Mn²⁺ rief eine ähnliche Aktivität wie Mg²⁺ hervor. Ferner unterschieden sich die getesteten Ionen in der Fähigkeit, das Ribozym korrekt zu falten. Insbesondere Mn²⁺ und Zn²⁺ wiesen anhand der gespaltenen Fraktion nach Reaktionsende eine eindeutige Unterstützung bis hin zu einer fast vollständigen Spaltung und somit Faltung des Ribozyms auf.<br /> Aufgrund der langsamen <i>in vitro</i> Reaktivität des rekonstruierten CPEB3 Ribozyms sollten co-transkriptionale Studien des vollständigen CPEB3 Ribozyms Einblicke in die reale Reaktionsgeschwindigkeit liefern. Durch ein unnatürliches Basenpaar sollte in einer Transkriptionsreaktion und einer Kopplungsreaktion eine Fluoreszenz-Sonde ortsspezifisch eingeführt werden. Das Reaktionsprofil entsprach den bisherigen Daten aus co-transkriptionalen Assays mit einer internen ³²P-Markierung.<br /> Strukturelle Studien des CPEB3 Ribozyms fokussierten sich auf die hochkonservierte Guanin-reiche Sequenz in der P1 Helix. Bei der Ribozym-Rekonstruktion aus drei kurzen Strängen aggregierte der Substratstrang in der denaturierenden PAGE Analyse zu einer langsam migrierenden Bande einer Struktur, die in Verbindung mit einem K+-haltigen Puffer eine starke Stabilität aufwies. Studien mittels der nativen und denaturierenden PAGE Analyse, CD Spektrometrie, UV Spektroskopie sowie 1D und 2D ¹H-NMR Spektroskopie bestätigten eine enorm stabile tetramolekulare, parallele G-Quadruplex-Struktur.<br /> Diese Arbeit bietet neue Einblicke in die Spaltung und Faltung des CPEB3 Ribozyms. Nebst den Indizien auf zwei ionisierbare Gruppen konnten erstmals Daten zur Involvierung weiterer Metall-Ionen in den Spaltungsmechanismus gesammelt werden. Zudem wurde in der CPEB3 Ribozym Sequenz ein potenziell <i>in vitro</i> relevantes Guanin-reiches Fragment identifiziert.<br />