Re-modelling of Mitochondrial Respiration in Arabidopsis during Drought

Abstract

Drought can severely limit growth and productivity of plants. To limit water loss by transpiration, plant leaves respond by reducing stomatal aperture. This simultaneously impairs CO₂ uptake and can reduce carbon assimilation. Sustained irradiance in the absence of sufficient CO₂ risks over-reduction of the photosynthetic and metabolic redox systems with potentially detrimental effects for the cell. In that situation, chloroplasts need to safely dissipate reductant for which several different mechanisms inside and outside the chloroplast have evolved. Mitochondrial electron transport can act as such an electron sink by reducing oxygen to water. The required capacity and flexibility to dissipate reductant are thought to be provided by uncoupling the electron flux to oxygen from the phosphorylation of ADP to ATP. Yet, our understanding of the significance, regulation and integration of the different uncoupling strategies in plant mitochondria is still limited. To investigate how (un-)coupling</nobr> impacts drought acclimation, I have manipulated mitochondrial uncoupling capacity by combining mutants of <em>Uncoupling Protein</em> (<em>UCP</em>) and <em>Alternative Oxidase</em> (<em>AOX1a</em>). Phenotyping revealed slightly decreased drought tolerance and reduced leaf rosette areas of plants restricted in uncoupling, but differences were minor compared to published mutant phenotypes. Previous reports indicated altered cellular energy physiology in response to drought-related stresses. I sought to refine our understanding of the changes at subcellular level by monitoring selected key parameters in response to drought and related stresses using fluorescent protein biosensors. Despite consistent increases of ATP levels and more oxidised NAD in response to drought, subsequent monitoring of uncoupling mutants did not reveal differences between genotypes under any of the conditions tested. Surprisingly, dithiothreitol (DTT), a widely used chemical to induce reductive ER stress, strongly impaired root growth of <em>aox1a</em> and <em>ucp1</em> uncoupling mutants. A connection between thiol-based reductive stress and mitochondrial electron transport flexibility has not been reported before, and was further investigated in isolated mitochondria. Measurements of oxygen consumption revealed increased respiration in response to DTT. Multiwell-based fluorimetric assays to monitor the proton motive force, pH gradient and membrane potential, and substrate depletion rates demonstrated that small thiol molecules can feed electrons into the electron transport chain. Based on the <em>in planta</em> and <em>in organello</em> insights, a refined model is proposed in which the mitochondria act as flexible cellular safe-guards against stress-induced cellular over- reduction not only by photosynthesis, but also by thiol-mediated reductive stress that may affect protein folding in the ER. <br /> Considering the critical interplay between plant respiratory physiology and mitochondrial architecture in stress responses, the final section of this thesis investigates intramitochondrial pH compartmentation. The successful establishment of lines targeting the cpYFP pH biosensor to different mitochondrial compartments enabled <em>in vivo</em> measurements of pH gradients between plant mitochondrial subcompartments, suggesting a pH gradient of 0.4 units across the inner mitochondrial membrane.

Trockenheit kann das Wachstum und die Produktivität von Pflanzen stark einschränken. Pflanzen können den Wasserverlust durch Transpiration über die Spaltöffnungen in den Blättern regulieren und somit minimieren. Dies wiederum beeinträchtigt die CO₂-Aufnahme und -Assimilation. Anhaltende Sonnenlichtexposition in Abwesenheit von ausreichend CO₂ birgt das Risiko einer Überreduktion der photosynthetischen und metabolischen Redoxsysteme mit potentiell schädlichen Auswirkungen auf die Zelle. In dieser Situation müssen Reduktionsäquivalente gezielt aus dem Chloroplasten abgeleitet werden, wofür verschiedene Mechanismen innerhalb und außerhalb des Chloroplasten bestehen. Der mitochondriale Elektronentransport kann durch die Reduktion von Sauerstoff zu Wasser als Akzeptor für überschüssige Reduktionsäquivalente dienen. Es wird angenommen, dass die erforderliche Kapazität und Flexibilität durch die Entkopplung des Elektronenflusses von der Phosphorylierung von ADP zu ATP bereitgestellt wird. Das Verständnis von der Bedeutung, Regulation und Integration der verschiedenen Entkopplungsstrategien in Pflanzenmitochondrien ist jedoch limitiert. Um die Auswirkungen der (Ent-) Kopplung auf die Akklimatisation der Pflanze an Trockenstress zu untersuchen, wurde die Entkopplungskapazität genetisch via <em>Alternative Oxidase</em> (<em>AOX1a</em>) und <em>Uncoupling Protein</em> (<em>UCP</em>) manipuliert. Die Phänotypisierung zeigte eine leicht verminderte Trockenstresstoleranz und verringerte Blattrosettenflächen bei Pflanzen mit eingeschränkter Entkopplung, wobei die Unterschiede im Vergleich zu veröffentlichten Phänotypen gering ausfielen. Frühere Berichte zeigten eine Veränderung der zellulären Energiephysiologie infolge von Trockenstress. Ich habe diese Veränderungen auf subzellulärer Ebene eingehender untersucht, indem ich ausgewählte Schlüsselparameter und deren Reaktion auf Trockenstress mithilfe fluoreszenter Proteinbiosensoren ausgelesen habe. Zwar bewirkte Trockenstress eine konstante Erhöhung der ATP-Konzentrationen und der Oxidationsraten von NAD im Wildtypen, die anschließenden parallelen Messungen mit den Entkopplungsmutanten zeigten unter den getesteten Bedingungen aber keine Unterschiede zwischen den Genotypen. Überraschenderweise schränkte Dithiothreitol (DTT), ein verbreitetes Reagenz zur Induktion von reduktivem ER-Stress, das Wurzelwachstum der Entkopplungsmutanten <em>aox1a</em> und <em>ucp1</em> stark ein. Ein Zusammenhang zwischen Thiol-basiertem reduktivem Stress und der Flexibilität des mitochondrialen Elektronentransportes wurde bisher nicht beschrieben und daher im Rahmen dieser Arbeit in isolierten Mitochondrien weiter untersucht. Messungen des Sauerstoffverbrauchs wiesen auf eine erhöhte Atmung nach Zugabe von DTT hin. Multiwell-basierte Fluorimetrie zur Aufzeichnung des pH-Gradienten und des Membranpotentials, den beiden Komponenten der protonenmotorischen Kraft, sowie die Messungen der mitochondrialen Atmungsraten zeigten, dass kleine Thiolmoleküle Elektronen in die Elektronentransportkette einspeisen können. Basierend auf den in <em>in planta</em> und in <em>in organello</em> Erkenntnissen wird ein neues Modell vorgeschlagen, in welchem die Mitochondrien als flexible Sicherheitsventile gegen stressinduzierte zelluläre Überreduktion fungieren. Somit bewahren Mitochondrien die Redox-Homöostase und damit vermutlich die Integrität des Photosynthese-Apparates und der oxidativen Proteinfaltung im ER. Der letzte Abschnitt dieser Arbeit widmet sich der intramitochondrialen pH-Kompartimentierung, welche sich in Stresssituationen abhängig von der Atmungsphysiologie der Pflanzen und der mitochondrialen Architektur verändert. Die erfolgreiche Etablierung von Pflanzenlinien, die den cpYFP pH-Biosensor in unterschiedlichen mitochondrialen Kompartimenten exprimieren, ermöglichte <em>in vivo</em> Messungen von pH-Gradienten zwischen mitochondrialen Kompartimenten der Pflanzen und deutet auf einen pH-Gradienten von 0,4 Einheiten über die innere mitochondriale Membran hin.