Formulierung von therapeutischen Oligonukleotiden mit PAMAM-Dendrimeren zur Aktivierung von <em>Pattern Recognition</em> Rezeptoren des angeborenen Immunsystems

Abstract

Der ubiquitär exprimierte Immunrezeptor <em>Retinoic Acid inducible Gene-I</em>, kurz RIG-I, ist eine zytosolisch lokalisierte Helikase, die zur Detektion von pathogenen RNA-Viren befähigt ist. Als synthetischer Ligand konnte eine 5‘-triphosphorylierte, doppelsträngige RNA (3pRNA) identifiziert werden, die wie auch die RNA der Viren an den Rezeptor bindet und nach dessen Aktivierung einer Reihe verschiedener Signalwege anstößt. So kommt es zur hauptsächlich zur Induktion und Sekretion von Typ-I Interferonen (IFNα/β) und dem davon abhängigen C-X-C Motiv Chemokin 10 (CXCL-10). Durch diese ausgeschütteten molekularen Signale wird eine anti-virale Immunantwort eingeleitet, die durch die Aktivierung und Rekrutierung weiterer Immunzellen neben der innaten auch die adaptive Immunantwort auslöst. Daneben führt die Aktivierung von RIG-I in Tumorzellen auch zur Einleitung eines proapoptotischen Signalwegs, der bedingt, dass die Zelle in den programmierten Zelltod geführt wird. Um diese immunologisch wertvollen Eigenschaften auch im Rahmen einer therapeutischen Anwendung nutzen zu können, muss die synthetisch hergestellte RNA jedoch gut verpackt werden. Denn einerseits bedingen äußere Einflüsse (RNasen) den Abbau der RNA-Moleküle, andererseits besitzt die RNA alleine aufgrund ihrer hohen negativen Ladung nicht die Möglichkeit in die Zelle und schon gar nicht bis ins Zytosol zu gelangen, wo der Rezeptor lokalisiert ist. Diese Verpackung ermöglichen virale aber auch nicht-virale Vektorsysteme, die die RNA schützen und auf verschiedensten Wegen die Aufnahme in die Zelle vermitteln. <br /> Ein vielversprechendes nicht-virales Vektorsystem stellen PAMAM-Dendrimere dar. Diese hochdefinierten, sphärische polymere Strukturen besitzen eine Größe von 1 bis 10 Nanometern und sind in der Lage aufgrund einzigartigen Struktur RNA an sich zu binden, aber auch in sich aufzunehmen. Aufgrund ihrer guten Biokompatibilität, ihrer geringen Toxizität und auch aufgrund ihrer modifizierbaren Oberfläche, werden sie besonders oft für den Einschuss toxischer Arzneimittel verwendet, um dessen Effektivität und Spezifität von erhöhen und die Nebenwirkungen der Therapie zu reduzieren. <br /> In dieser Arbeit wurden PAMAM-Dendrimere als Vektorsysteme für 3pRNA zur Aktivierung von RIG-I, aber auch für Liganden der endosomal lokalisierte Nukleinsäure-bindenden Rezeptoren Toll-like Rezeptor 7 und 8 (TLR7 / 8) evaluiert. Es stellte sich heraus, dass die so hergestellten Dendriplexe neben einer hohen Transfektionseffizienz <em>in vitro</em> auch <em>in vivo</em> ein hohes Transferpotential besitzen. Diese <em>in vivo</em> Anwendbarkeit machte einen therapeutischen Einsatz der 3p-Dendriplexe im murinen hepatozellulären Karzinom, sowie im murinen Melanommodell möglich und führte sowohl intravenös als auch intratumoral verabreicht zu einer starken Tumorregression und zu einem verlängerten Überleben der Tiere. Zudem zeigte sich in Reprovokationsstudien an tumorfreien Tieren, dass die Behandlung einen immunologischen Schutz bewirkt, der das Anwachsen neuer Tumore verhindert. <br /> Durch die Herleitung einer maschinellen Herstellungsmethode war es am Ende möglich durch einen hochdefinierten und kontrollierbaren Prozess stabile 3p-Dendriplexe zu produzieren. Diese Methode bietet eine solide erste Grundlage die Herstellung von 3p-Dendriplexen als direkt applikationsfähige Arzneiform auch im Großmaßstab unter GMP zu ermöglichen.