Studies on nematode factors activating the plant immune system

Abstract

Plant-parasitic nematodes are destructive pests causing crop losses accounting for billions of dollars annually. To defend against invading pathogens plants rely on innate immune system which involves the recognition of microbe/pathogen associated molecular pattern (MAMPs/PAMPs) and endogenous damage associated molecular pattern (DAMPs), by plasma membrane localized pattern recognition receptors (PRRs). Recognition of these molecular signatures activates responses as Pathogen Associated Molecular Pattern-Triggered immunity (PTI). The role of PTI during plant pathogen interaction has been well studied for many microbes of pathological importance, but not well described for plant nematode interactions. <br /> Here we examined the role of PTI at early stages of nematode infection on plants. We describe the activation of PTI responses in <em>Arabidopsis thaliana</em> by a nematode aqueous <em>diffusate</em> termed NemaWater in a manner depending on a common co-receptor BAK1. Experiments performed after treatment of NemaWater with proteinase K and also with heating, reduce the PTI-like responses observed in untreated NemaWater samples. These results further indicate that the elicitor/s contained in NemaWater is/are of proteinaceous in nature. Considering the role played by BAK1 as co-receptor specifically for those PRRs that recognizes proteinaceous ligands, we identified a leucine-rich repeat receptor-like kinase, termed NILR1 that was specifically regulated upon infection by nematodes. Loss-of-function mutants of NILR1 were hypersusceptible to several nematode species and exhibited impaired PTI responses triggered by NemaWater. We show that NILR1 is essential for PTI responses initiated by nematodes (Chapter 2). <br /> NemaWater protein fraction analysis revealed the presence of nematode proteins components including surface coat associated proteins (Chapter 3). We hypothesize that plants are able to recognize nematode through an unknown conserved protein molecule possibly exposed on the surface of the nematode cuticle. <br /> Apart from recognition of conserved nematode associated molecular patterns by PRRs, plant innate immunity can also be activated as a result of cell damage and subsequent release of endogenous DAMP molecules. Plant invasion by nematodes and migration through cells causes cell-damage and possible release of cell wall fragments either in the form of oligogalacturionides (OGs), ATP, or small peptides that can act as DAMPs and activate host defence responses. These molecular mechanisms mediating damage responses during plant-nematodes interactions are not well understood. Here we report that polygalacturonase-inhibiting proteins (PGIPs) genes involved in the formation of active OG elicitors in Arabidopsis were strongly induced in response to cyst nematodes. Experiments with loss-of-function mutants and overexpression lines showed an increased and reduced cyst nematode infection, respectively. These finding suggest that cyst nematode during migration within the root cause cell damage which as a result induce camalexin and indole-glucosinolate biosynthesis pathways in a PGIP- dependent manner thereby restricting nematode establishment and development (Chapter 4). The exact ligands that interact directly with PGIPs and how active OGs are formed and act as elicitors of defense during nematode infection of plants are still elusive.<br /> In Chapter 5, we studied the Arabidopsis peptide receptor (AtPEPRs) and their role in defense responses against nematode. Our result showed a high susceptibility of <em>pepr1/2 </em> double mutant to cyst nematode. In contrast, we did not observe significant differences in root-knot nematode infection of <em>pepr1/2</em> mutant compared to control. <br /> This study clearly indicates that plants have a recognition mechanism for nematode elicitors as well as host derived elicitors released as a result of cell damage caused by nematodes. Understanding how both defense regulation pathways function together will provide valuable information for engineering durable crop resistance against plant parasitic nematodes and increase crop yield.

<strong>Untersuchungen zur Aktivierung des pflanzlichen Immunsystems durch von Nematoden gebildete Faktoren</strong><br /> Pflanzenparasitäre Nematoden sind wichtige Schaderreger, die jährlich Ertragsverluste von vielen Milliarden Dollar verursachen. Pflanzen verteidigen sich gegen eindringende Pathogene mit Hilfe ihres Immunsystems, das auf der Erkennung von "Microbe/Pathogen Associated Molecular Patterns" (MAMPs/PAMPs) und endogenen "Damage Associated Molecular Patterns" (DAMPs) durch in der Plasmamembran lokalisierte Pattern Recognition Receptors (PRR) beruht. Die Erkennung der molekularen Signaturen führt zur Aktivierung der "Pattern-Triggered Immunity" (PTI). Die Rolle der PTI ist für eine Reihe von wichtigen Pflanzen-Pathogen-Interaktionen gut untersucht, für die Interaktion zwischen Pflanzen und Nematoden aber kaum bekannt. <br /> Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle von PTI in der frühen Infektionsphase zu untersuchen. Es zeigte sich , dass PTI in <em>Arabidopsis thaliana</em> durch eine wässrige Lösung von Nematodenausscheidungen, die als NemaWater bezeichnet wurde, in Abhängigkeit vom Ko-Rezeptor BAK1 ausgelöst wird. Die Behandlung von NemaWater mit Proteinase K und Hitze reduzierten die PTI-artigen Pflanzenreaktionen, die mit unbehandeltem NemaWater ausgelöst werden. Daraus kann geschlossen werden, dass in NematWater enthaltene Elizitoren aus Protein bestehen. Unter Einbeziehung der Rolle, die der BAK1 Korezeptor spezifisch zusammen mit den PRR spielt, die Proteinliganden erkennen, gelang es uns, eine nematoden responsive Leucine-Rich Repeat Receptor-like Kinase zu identifizieren, die wir als NILR1 bezeichneten. Funktionsverlust-Mutanten von NILR1 waren gegenüber mehreren Nematodenarten hypersuszeptibel und zeigten nach NemaWater-Behandlung eine eingeschränkte PTI-Reaktion. Wir konnten zeigen, dass NILR1 eine essentielle Rolle für die Auslösung von PTI durch Nematoden spielt (Kapitel 2). <br /> Analysen der Proteinfraktion von NemaWater ergaben, dass sich darin verschiedene Nematodenproteine einschließlich Proteine der Nematodenoberfläche (Kapitel 3) befanden. Daher stellen wir die Hypothese auf, dass Pflanzen in der Lage sind, Nematoden anhand einer bisher unbekannten konservierten Proteinmoleküls zu erkennen, das möglicherweise auf der Oberfläche der Kutikula präsentiert wird. <br /> Neben der Erkennung von "Nematode Associated Molecular Patterns" durch PRR kann das pflanzliche Immunsystem auch durch geschädigte Zellen und nachfolgend freigesetzte endogene DAMP Moleküle aktiviert werden. <br /> Wenn Nematoden in Pflanzen eindringen und durch Zellen wandern verursachen sie Zellschäden und damit möglicherweise die Freisetzung von Zellwandbestandteilen entweder in Form von Oligogalacturoniden (OGs), kleinen Peptiden oder ATP-Molekülen, die als DAMPs die Wirtsabwehr aktivieren können. Die molekularen Abläufe während der Interaktion zwischen Pflanzen und Nematoden im Zusammenhang mit der Reaktion auf Zellschäden sind weitgehend unbekannt. Wir konnten zeigen, dass Gene, die für Polygalacturonase-Inhibiting Proteins (PGIPs) kodieren und für die Bildung von OG-Elizitoren in Arabidopsis verantwortlich sind, im Verlauf der Infektion durch Zystennematoden stark aufreguliert sind. Experimente mit Funktionsverlust-Mutanten und Überexpressionslinien zeigten eine gesteigerte bzw. reduzierte Nematodeninfektion. Diese Ergebnisse zeigen, dass Zystennematoden während der Wanderung durch die Wurzel Zellschäden verursachen und abhängig von PIGPs die Biosynthesewege von Camalexin und Indol-Glukosinolaten aktivieren, wodurch sie die Etablierung und die Entwicklung von Nematoden einschränken (Kapitel 4). Allerdings ist noch nicht bekannt, welche Moleküle als Liganden der PGIPs agieren, wie OGs gebildet werden und wie diese als Elizitoren der Abwehrreaktion gegen Nematoden agieren. <br /> In Kapitel 5 wird beschrieben, wie die Rolle von Peptidrezeptoren in Arabidopsis (AtPEPRs) bei der Abwehr gegen Nematoden untersucht wurde. Die Doppelmutante <em>pepr1/2</em> war gegenüber Zystennematoden hoch anfällig, zeigte aber in der Reaktion auf den Befall von Wurzelgallennematoden keine signifikanten Unterschiede zur Kontrolle. <br /> Die hier beschriebenen Untersuchungen zeigen, dass Pflanzen einen molekularen Mechanismus besitzen, mit dem sie aus Nematoden stammende Elizitoren und pflanzliche Elizitoren, die durch Nematoden verursachte Zellschäden freigesetzt werden, erkennen können. Erkenntnisse, die dazu führen, zu verstehen, wie beide Abwehrwege zusammenspielen, geben wertvolle Informationen zur Entwicklung von dauerhafter Resistenz gegen pflanzenparasitäre Nematoden.