Biomechanische Untersuchungen zur Rolle des Zytoskeletts für die mechanische Anisotropie und Dehnbarkeit von Monolagen epithelialer Zellen

Abstract

<p>Die Haut ist eines der faszinierendsten Organe des menschlichen Körpers. Kenntnisse über ihre mechanischen Eigenschaften sind insbesondere in der Medizin von hoher Relevanz, wie z.B. während chirurgischer Eingriffe oder bei Hauttransplantationen. Obwohl die mechanischen Eigenschaften der Haut bereits lange Forschungsgegenstand waren, sind die dahinter stehenden molekularen Mechanismen kaum bekannt. Aus diesem Grund beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit einzelnen Hautschichten, Monolagen von Keratinozyten, welche mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie Studien der intrazellulären Strukturen ermöglichen. Zellmonolagen stellen dabei das einfachste multizelluläre Gewebe dar, an dem sich dieWechselwirkungen von Zellen u.a. anhand der interzellulären Verbindungen, wie Adherens Junctions und Desmosomen, untersuchen lassen. Sie ermöglichen außerdem eine explizite Manipulation des Zytoskeletts, einem komplexen, hochadaptiven System das maßgeblich den Zellen Form und mechanische Stabilität verleiht. Das Zytoskelett setzt sich aus drei filamentösen Netzwerken zusammen, die sich in ihren Eigenschaften ergänzen und miteinander wechselwirken können. <br /> In dieser Arbeit wurde das Wechselspiel der mechanischen Eigenschaften epithelialer Monolagen mit der Organisation dieser zytoskelletalen Untersysteme analysiert. Der dazu verwendete Ansatz basiert auf elastischen Silikonkautschukkammern, in denen eine physiologische Kultivierung von Zellmonolagen möglich ist. Diese Kammern sind über einen weiten Bereich linear elastisch und können mit Hilfe einer speziell dazu angefertigten Apparatur Mikrometer-genau gedehnt werden. <br /> Weiterhin wurde ein zyklisches Dehnungsprotokoll verwendet, mit Hilfe dessen die auf den Kammern befindlichen Zellen entlang einer Achse senkrecht zur Dehnungsrichtung ausrichtet werden können. Insbesondere wurde dadurch auch das Aktinzytoskelett der Zellen entlang derselben Achse ausgerichtet, womit ein biologisches Material mit veränderten mechanischen Eigenschaften erzeugt werden konnte. Einer der Schwerpunkte der Arbeit lag dabei auf der Kontraktilität und der Bruchdehnung dieser ausgerichteten Zellmonolagen, wobei ein mechanisch stark anisotropes Verhalten der Monolagen herausgearbeitet werden konnte. Insbesondere konnte dabei gezeigt werden, dass die von den Monolagen generierten Kräfte in Ausrichtungsrichtung um eine Größenordnung höher sind als senkrecht dazu. Auch der Einfluss der zellulären Ausrichtung für die Bruchdehnung der Monolagen konnte mit diesem System bestimmt werden. Diese war entlang der zellulären Ausrichtungsrichtung signifikant kleiner als senkrecht dazu, wodurch eine weitere stark anisotrope Eigenschaft in ausgerichteten Zellschichten nachgewiesen werden konnte. <br /> In einer weiteren Experimentreihe wurde der Einfluss der Keratine, einem weiteren zytoskelletalen Netzwerk, auf die Steifigkeit der Monolagen unter Dehnung untersucht. Obwohl Keratine einen Proteinanteil in Epithelien von bis zu 85% ausmachen können, bleiben ihre Funktionen in Zellen bisher weitestgehend ungeklärt. Daher wurden hier vergleichende Experimente einer Keratin-freien Keratinozyten-Zelllinie mit ihrem zugehörigen Wildtyp durchgeführt. Diese Keratin-knock-out Mutante wurde von der AG Magin (Leipzig) etabliert. Für die Analysen wurde ein neuer kombinierter Ansatz aus einem Rasterkraftmikroskop, einem Zellstretcher und einem Lichtmikroskop verwendet. Mit diesem war es möglich, Zellen bis zu 50% zu dehnen und durch lokale Mikroindentationen mechanisch zu analysieren. Insbesondere konnten damit die gleichen Zellen, die zuvor im relaxierten Zustand untersucht wurden, nach der Dehnung wiedergefunden werden. Damit konnte der Anstieg der Steifigkeiten einzelner Zellen ermittelt werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass Keratinozytenmonolagen sowohl bei 25% als auch bei 50% Dehnung signifikant versteifen. Um den Einfluss der Keratine auf das Verhalten der Monolagen unter Dehnung zu untersuchen, wurden diese Messungen mit der Keratin-freien Mutante wiederholt. Dabei reagierte die Keratin-KO-Mutante mit einer verringerten Versteifung unter Dehnung.</p>