Evaluation of protective immune responses against <em>Litomosoides sigmodontis</em> and analysis of <em>L. sigmodontis</em> extract on T cell modulation and glucose tolerance in diet-induced obese mice

Abstract

Parasitic helminths are responsible for numerous tropical diseases which represent a major health problem in tropical and subtropical regions such as lymphatic filariasis (elephantiasis), causing lymphedema in limbs and scrotum in lymphatic filariasis patients and onchocerciasis (river blindness) leading to blindness and severe dermatitis in onchocerciasis patients. Helminths modulate the immune system of their hosts to their benefit, enabling and prolonging parasite survival in the host. On the other hand, several human and animal studies confirmed a protective effect of helminth infections and worm extracts on allergic and autoimmune diseases and more recently on metabolic diseases such as diet-induced insulin resistance. In order to obtain a better understanding of filarial immunomodulation and protective immune responses against filariae, the <em>Litomosoides sigmodontis </em> model was used. As type 2 immune responses are in general associated with protective immune responses against filariae, the present thesis directly assessed the role of eosinophils, IL-5 and IL-4R on <em>L. sigmodontis</em> infection. Therefore, wild-type (WT) BALB/c mice and mice deficient for eosinophils (dblGATA), IL-5, IL-4R and both IL-5/IL-4R were used. Analyses were performed at the peak of microfilaremia (71 days post infection (dpi)) and during a late time point of infection (119dpi). Following necropsy parasitological (worm and microfilaria load) as well as immunological parameters (cytokine levels, major immune cell types) within the thoracic cavity (the site of adult worm residence) and the spleen were analysed. A negative correlation between thoracic cavity eosinophil numbers and the adult worm burden as well as microfilaremia was observed. Alternatively activated macrophages (AAMs) correlated negatively with microfilaremia and positively with the adult worm load, which was associated with an extended adult worm survival in dblGATA, IL-5^-/- and IL-4R^-/-/IL-5^-/- mice. Mice deficient for IL-4R/IL-5 had the highest susceptibility for <em>L. sigmodontis</em> infection, an earlier onset of microfilaremia, highest microfilariae (MF) loads and an extended adult worm survival. Another focus of this dissertation was the role of the damage-associated proteins S100A8/A9 during <em>L. sigmodontis</em> infection. S100A8/A9 was shown to provide an anti inflammatory effect within the lung during the migratory phase of infective L3 larvae. Therefore, S100A8/A9^-/- mice exhibited a decreased worm burden, which was associated with an increased inflammatory immune response within the lung compared to WT controls. The reduced worm burden in S100A8/A9^-/- mice was also given following subcutaneous (s.c.) infection and the immune response within the skin was not altered in comparison to WT controls. The S100A8/A9-mediated protective mechanisms occurred in the lung via neutrophils, but not in the skin. Furthermore, the impact of the aryl hydrocarbon receptor, belonging to the family of Pattern Recognition Receptors (PRRs), during <em>L. sigmodontis</em> infection was analyzed. AhR^-/- mice exhibited an increased worm burden, which was presumably based on limited protective immune responses within the skin and increased vascular permeability, facilitating larval migration and parasite survival. <br /> The next part of this thesis studied the beneficial immunomodulatory effect of <em>L. sigmodontis</em> adult worm extract (LsAg) during diet-induced glucose intolerance and T cell inflammation. Repeated intraperitoneal (i.p.) injections of LsAg improved glucose tolerance, but not insulin sensitivity in obese mice. The protective effect was associated with a decreased type 1 inflammation in adipocytes, which represent a main cause of insulin resistance. IFN-γ, TNF and IL-17 were decreased in CD4+ T cells in LsAg treated mice. Furthermore TNF and IL-17 were significantly lower in CD8+ T cells in LsAg-treated animals compared to corresponding controls. Our study revealed that filarial extracts present potential candidates to treat diet induced insulin resistance. Finally, I contributed to the identification of novel macrofilaricidal compounds by <em>in vivo</em> testing in the <em>L. sigmodontis </em>rodent model with several industry partners.

Parasitäre Helminthen sind für eine Vielzahl von tropischen Krankheiten verantwortlich, die ein großes Gesundheitsproblem in den Tropen und Subtropen darstellen. Bei der lymphatischen Filariose (Elephantiasis) leiden Patienten unter Lymphödemen in den Gliedmaßen und bei der Onchozerkose (Flussblindheit) unter schwerwiegender Dermatitis sowie Blindheit. Helminthen modulieren das Immunsystem ihres Wirtes zu ihrem Vorteil, welches das langfristige Überleben des Parasiten im Wirt ermöglicht. Zudem belegen humane und tierexperimentelle Studien, dass Helmintheninfektionen und -extrakte Allergien, Autoimmunerkrankungen sowie metabolische Krankheiten lindern und sogar verhindern können. Neue Therapieansätze gegen Filarieninfektionen, Allergien und Autoimmunerkrankungen werden mittels des Models <em>L. sigmodontis</em> untersucht und identifiziert. In der vorliegenden Arbeit wurde der direkte Einfluss von Eosinophilen, IL-5 und IL-4R auf die <em>L. sigmodontis </em> Infektion in WT BALB/c Mäusen und Mauslinien, welche defizient für Eosinophile (dblGATA), IL-5, IL-4R und IL-5/IL-4R sind, untersucht. Parasitologische sowie immunologische Parameter wurden während des Mikrofilarienpeaks (71dpi) und zu einem späten Zeitpunkt der Infektion (119dpi) analysiert. In der Pleuralhöhle befindliche Eosinophile korrelierten negativ mit der adulten Wurm- und Mikrofilarienlast. Alternativ aktivierte Makrophagen korrelierten ebenfalls negativ mit der Mikrofilarämie, jedoch positiv mit der adulten Wurmlast, die mit einer erhöhten Lebenserwartung der adulten Würmer in den Eosinophil-defizienten Mauslinien assoziiert war. Dabei konnte festgestellt werden, dass die IL-4R/IL5 defizienten Tiere alle MF positiv waren. Zusätzlich wiesen diese Tiere die höchste Mikrofilarienlast auf, die zusätzlich mit einer frühzeitigen Mikrofilarienfreisetzung assoziert war.<br /> Des Weiteren wurde im Rahmen dieser Dissertation eine anti-inflammatorische Rolle für S100A8/A9 in der Lunge während der <em>L. sigmodontis</em> Infektion nachgewiesen S100A8/A9^-/- Mäuse waren durch eine geringere Adultwurmlast charakterisiert, die zusätzlich mit einer verstärkten inflammatorischen Immunantwort in der Lunge im Vergleich zu den WT Kontrollen assoziiert war. Subkutane und intradermale Injektionen von infektiösen L3 Larven in S100A8/A9^-/- Mäusen hatten keinen Einfluss auf die Infektionslast. Dies zeigt, dass S100A8/A9-assozierte Immunantworten in der Haut nicht die Wurmlast beeinflussen. Zudem konnte gezeigt werden, dass ein durch Neutrophile initiierter protektiver Mechanismus in der Lunge stattfindet, da die Depletion von Neutrophilen in der Lunge in einer erhöhten Wurmlast in S100A8/A9^-/- Tieren resultierte.<br /> Ein weiterer Teil der Dissertation beschäftigte sich mit dem Einfluss des Aryl Hydrocarbon Rezeptors (AhR) auf die <em>L. sigmodontis</em> Infektion. AhR^-/- Mäuse waren durch eine erhöhte Wurmlast charakterisiert, die vermutlich auf eingeschränkte Immunantworten innerhalb der Haut, der Pleuralhöhle sowie einer erhöhten vaskulären Permeabilität zurückzuführen ist. Zusätzlich wurde in dieser Thesis der Effekt von adultem <em>L. sigmodontis</em> Wurmextrakt während einer Diät-induzierten Glukoseintoleranz auf die Zytokinproduktion von T Zellen untersucht. Intraperitoneale Injektionen von LsAg verbesserten die Glukosetoleranz, jedoch hatten keinen Einfluss auf die Insulintoleranz in adipösen Mäusen. Dieser protektive Effekt war mit einer verminderten Typ 1 Inflammation in den Adipozyten assoziiert. Darüber hinaus resultierte die Behandlung mit LsAg in einer verringerten pro-inflammatorischen Zytokinproduktion in CD4+ (IFNγ, TNF, IL-17) und CD8+ T Zellen (TNF, IL-17) im Vergleich zu PBS behandelten adipösen Kontrolltieren. Zusammengefasst stellen Filarienextrakte vielversprechende neue Therapieansätze für die Diät-induzierte Insulinresistenz dar. Letztendlich unterstütze ich die Identifizierung neuer makrofilarizider Substanzen im L<em>. sigmodontis</em> Nagetiermodell, die in enger Zusammenarbeit mit diversen Industriepartnern durchgeführt wurden.