Biochemical and structural characterization of the NLRP3 inflammasome

Abstract

The innate immune system utilizes inflammasome proteins to recognize danger signals and to fight invading pathogens. To date, the most studied inflammasome protein is NLRP3 - a multidomain protein, composed of a N-terminal PYD-domain, a central NACHT-domain and a C-terminal LRR-domain. NLRP3 was further grouped into the family of AAA+ ATPases. NLRP3 inflamasome formation has previously been shown to depend on atwo-step mechanis: A priming event, initiating the transcriptional upregulation of NLRP3, and an activation event. Nontheless, the mechanisms underlying self-regulation and activation of NLRP3 remain illusive. <br /> The present study sheds light on both, structural and functional aspects of NLRP3 activation-mechanisms and it’s mode of action. Recombinant human MBP-NLRP3 was found to assemble into two oligomeric entities, with deviating biochemical characteristics. A larger protein complex (about 25 MDa) was shown to possess ATP hydrolysis activity, whereas a second species assembled into an inactive octameric to decameric oligomer complex. Moreover, the ATP hydrolysis activity of NLRP3, was shown to go along with a phosphorylation of Ser198, previously identified to regulate NLRP3 inflammasome activation.Characterization of the ATP-binding site by in-silico analysis, followed by a mutational approach, confirmed and revealed amino-acid residues involved in ATP-binding and hydrolysis of NLRP3. The Walker A motif (K232) and the sensor 1 motif (R351) have been confirmed to be crucial for the ATPase activity of NLRP3. Moreover, the Walker B residues G303, D305 and E306 have been shown to be equally important for maintaining ATP hydrolysis activity. The highly conserved histidine residue (H522) was also identified to be essential to the ATP hydrolysis activity of NLRP3 and is thus assumed to take over the function of sensor 2 in NLRP proteins. The amino acids identified as crucial to ATP-hydrolysis in NLRP3suggest a mechanism, deviating from the classical mechanism described for AAA+ ATPases.Finally, the data presented here assign a new function to the NLRP3 inflammasome protein: Adenylate kinase activity. NLRP3 was shown to convert 2 x ADP into 1 x AMP and 1 x ATP and also to mediate the reverse reaction: 1 x AMP+1 x ATP to 2 x ADP. Amino acid residues involved in the process could be identified by introduction of point mutations. <br /> Furthermore, a connection between the CAPS disease and NLRP3 mediated AK-activity was identified. Altogether, the present study supports the model of NLRP3 being an intracellular NTP-sensor and provides new insights into the activation mechanism of NLRP3.

<strong>Biochemische und strukturelle Characterisierung des NLRP3 Inflammasoms</strong> <br /> Inflammasomproteine dienen dem angeborenen Immunsystem zur Erkennung und zur Abwehr von Krankheitserregern. Das bis heute bestuntersuchte Inflammasomprotein ist NLRP3 – ein Multidomänenprotein, bestehend aus einer N-terminalen PYD Domäne, einer zentral gelegenen NACHT-Domäne, sowie einer C-terminalen LRR-Domäne. Darüber hinaus wurde NLRP3 der Familie der AAA+ ATPase zugeordnet.Bislang konnte gezeigt werden, dass die Entstehung des NLRP3-Inflammasoms auf einem zweistufigen Aktivierungsmechanismus fußt: Einem ‚priming-event‘, welches die vermehrte NLRP3 Transskription initiiert, sowie einem daraffolgenden ‚activation-event‘. Nichtsdestotrotz bleiben die der Aktivierung von NLRP3 zu Grunde liegenden Mechanismen bislang weitgehend ungeklärt. <br /> Die vorliegende Studie beleuchtet sowohl strukturelle als auch funktionelle Aspekte der NLRP3-Aktivierung. Es konnte gezeigt werden, dass rekombinantes, humanes MBP-NLRP3 zwei verschiedene oligomere Stadien einnimmt, welche unterschiedliche biochemische Charakteristiken aufweisen. Für den größeren Proteinkomplex (ca. 25. MDa) konnte ATP-Hydrolyseaktivität nachgeweisen werden, während sicheine zweite, inaktive, Spezies bildet, welche eine Größe im Bereich eines Okta-, Nona- oder Dekameres aufweist. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die ATP-Hydrolyseaktivität von NLRP3 mit einer Phosphorylierung an Position Ser198 einhergeht, welche zuvor bereits alsfür die Regulation des NLRP3 Inflammasoms essentiell nachgewiesen werden konnte. Durch eine in-silico Analyse der ATP-Bindestelle, sowie eine darauf folgende Mutationsanalyse, konnten mehrere an der ATP-Hydrolys beteiligte Aminosären identifiziert oder bestätigt werden. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl das Walker A motif (K232) sowie das Sensor 1 Motif (R351) für die ATPase Aktivität von NLRP3 essentiell sind. Auch die im Walker B Motiv konservierten Reste G303, D305 und E306 wurdenals für die ATP Hydrolyseaktivität essentiell bestätigt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass das hochkonservierte His522 für die ATP Hydrolyseaktivität unerlässlich ist, und somit potentiell die Funktion des Sensor 2 in NLRP Proteinen übernimmt. Die hier als für die ATPase Aktivität von NLRP3 essentiell identifizierten Aminosäurereste suggerieren somit einen von den klassischen AAA+ ATPase abweichenden Hydrolysemechanismus. <br /> Schlussendlich kann NLRP3, auf Basis der hier presentierten Daten, eine neue Fuktion zugewiesen werden: Adenylatkinaseaktivität. Es konnte gezeigt werden, dass NLRP3 in der Lage ist sowohl die Synthese von einem Molekül AMP und einem Molekül ATP aus zwei Molekülen ADP zu bewerkstelligen, als auch die Rückreaktion zu vermitteln: 1 x AMP + 1 x ATP zu 2 x ADP. <br /> Durch das Einfügen von Punktmutationen konnten die an der Adenylatkinasereaktion beteiligte Amminosäurereste identifiziert werden. Außerdem konnte eine Verbindung zwischen der CAPS Krankheitund der von NLRP3 vermittelten AK-Aktivität ermittelt werden.Die vorliegende Arbeit unterstützt somit das Modell des NLRP3 Proteins als intrazellulärem NTP-Sensor und bietet neue Einblicke in den Aktivierungsmechanismus von NLRP3.