Recognition of cytosolic 3´P DNA & The role of GCET2⁺ DCs in cross-presentation

Abstract

In mammalian cells, DNA is confined to the nucleus and mitochondria. Detection of DNA in other compartments like the cytoplasm indicates danger and infection. Our research group has previously discovered that 3´monophosphate end modifications augment cytosolic immune recognition of DNA. I could show that DNA with this 3´phosphate modification and DNA without it are similarly recognized by the cGAS-STING and AIM2-ASC pathways, leading to the secretion of inflammatory cytokines by immune cells. However, in contrast to unmodified DNA, 3´monophosphorylated DNA was not degraded by the cytosolic DNase TREX1. The 3´monophosphate group has been shown to prevent binding of the DNA by TREX1 and thereby mediating the resistance of the DNA towards degradation. Using directed mutagenesis of the DNA binding site of TREX1 I tried to lift this block imposed by the 3´phosphate group. However, the specificity of TREX1 to not accept DNA with this modification proved to be highly robust. In order to investigate the source of 3´monophosphorylated DNA more profoundly, I developed an assay for the quantification of DNA with this modification in a sample. I also investigated the fate of cytosolic 3´monophosphorylated DNA. Cellular phosphatases might remove the 3´phosphate and allow TREX1-dependent degradation. Therefore, I investigated three known DNA repair proteins with putative or proven 3´phosphatase function and studied the phosphatase PNKP, which was the only candidate able to efficiently remove 3´phosphates from DNA in cell lysates when overexpressed, in greater depth. I studied cells with a knockout for PNKP, cells in which PNKP was overexpressed, and cells in which the function of PNKP was blocked by an inhibitor. Nevertheless, I could not detect a significant effect of PNKP on the innate immune response to 3´P DNA in these settings. In conclusion, I propose 3´P DNA as danger associated molecular pattern. Insights into the origin, recognition and degradation of 3´monophosphorylated DNA might allow us to prevent inflammation when it is harmful like in autoimmune diseases and to promote inflammation and the subsequent activation of the immune system in situation where it is beneficial like during vaccination or the treatment of cancer.<br /> In a second project, I studied the role of GCET2⁺ dendritic cells in cross-presentation. This is an important immunological process in the development of cytotoxic CD8⁺ T cells, in which a subpopulation of dendritic cells presents extracellular antigens to the cytotoxic CD8⁺ T cells. GCET2 has been identified as a bona fide genetic marker for cross-presenting dendritic cells in our laboratory. I characterized two transgenic mouse strains that express the human diphtheria toxin receptor under the control of the GCET2 promoter. The cells expressing the diphtheria toxin receptor can be ablated in living mice by the administration of diphtheria toxin, allowing the investigation of their functions. I found GCET2⁺ dendritic cells to be positive for the surface markers CD11c, CD8α, and XCR1 and negative for the surface markers CD4, CD11b, and SIRPα. Depletion of GCET2⁺ dendritic cells impaired cross-presentation and thereby showed that GCET2⁺ dendritic cells are crucial for this process. XCR1⁺ dendritic cells have been established as cross-presenting dendritic cells. I compared GCET2⁺ dendritic cells and XCR1⁺ dendritic cells and found no differences in function, localization, and gene expression. Further understanding of cross-presenting dendritic cells might support the development of new vaccination strategies for the prevention and treatment of infections and cancer.

<strong>Erkennung von zytosolischer 3´P DNA & die Rolle von GCET2-positiven dendritischen Zellen in der Kreuzpräsentation</strong><br /> In menschlichen Zellen befindet sich die Erbsubstanz oder DNS ausschließlich im Zellkern und den Mitochondrien. Die Anwesenheit von DNS in anderen Teilen der Zellen, wie dem Zytoplasma, weißt dagegen auf Gefahr oder Infektionen hin. Unsere Forschungsgruppe hat zuvor herausgefunden, dass die Modifikation von DNS mit einer Phosphat-Gruppe an deren 3´Ende die Immunerkennung der DNS im Zytoplasma verstärkt. Ich konnte zeigen, dass DNS mit dieser 3´Phosphat-Modifikation ebenso von den cGAS-STING- und AIM2-ASC-Signalwegen erkannt wird, wie nicht-modifizierte DNS. Dies führt zur Freisetzung von entzündungsfördernden Botenstoffen durch Immunzellen. Im Gegensatz zu nicht-modifizierter DNS, kann 3´Phosphat-DNS nicht durch die zytosolische DNase TREX1 abgebaut werden. Es konnte zuvor gezeigt werden, dass die Phosphat-Gruppe am 3´-Ende die Bindung der DNS durch TREX1 verhindert und dadurch den Abbau der DNS durch TREX1 blockiert. Mit Hilfe von gezielter Veränderung der DNS-Bindetasche von TREX1 habe ich versucht, diese Blockade durch die Phosphat-Gruppe zu umgehen. Allerdings erwies sich die Spezifität von TREX1, DNS mit einer 3´Phosphat-Modifikation nicht als Substrat zu akzeptieren, als sehr robust. Um die Quellen von 3´Phosphat-DNS besser identifizieren zu können, habe ich eine Methode zur Quantifizierung von DNS mit dieser Modifikation entwickelt. Ebenso habe ich näher untersucht, was mit 3´Phosphat-DNS im Zytoplasma geschieht. Zelluläre Phosphatasen könnten die modifizierte DNS dephosphorylieren und damit einen Abbau durch TREX1 ermöglichen. Deshalb habe ich drei bekannte DNA-Reparatur-Proteine mit mutmaßlicher beziehungsweise bewiesener 3´Phosphatase-Funktion untersucht und die Phosphatase PNKP näher erforscht, welche als einzige der Kandidaten in Zell-Lysaten, in denen sie überexprimiert vorlag, 3´Phosphate von DNA entfernt hat. Ich untersuche Zellen, in denen PNKP entfernt wurde, Zellen, in denen die Funktion von PNKP durch einen Inhibitor blockiert wurde und Zellen, in denen PNKP über-exprimiert wurde. Dennoch konnte ich keinen signifikanten Effekt von PNKP auf die direkte, angeborene Immunantwort auf 3´Phosphat-DNS feststellen. Zusammenfasend schlage ich 3´Phosphat DNA als Gefahren-assoziiertes molekulares Muster vor. Ein tieferes Verständnis der Quellen, der Erkennung und des Abbaus von 3´Phosphat-DNS kann uns helfen, Entzündung zu reduzieren, in Situationen in denen Entzündung schädlich ist, wie bei Auto-Immun-Erkrankungen. In anderen Fällen, in denen Entzündung förderlich ist, kann ein tieferes Verständnis uns helfen, Entzündungen und die darauf folgende Aktivierung des Immunsystems zu verstärken, wie bei Impfungen oder der Behandlung von Krebs.<br /> In einem zweiten Projekt habe ich die Rolle von GCET2-positiven dendritischen Zellen im Prozess der Kreuzpräsentation untersucht. Dies ist ein wichtiger immunologischer Prozess in der Entwicklung von zytotoxischen CD8-positiven T-Zellen, sogenannten T-Killer-Zellen, in welchem eine Teil-Population der dendritischen Zellen den zytotoxischen CD8-positiven T-Zellen Antigene präsentieren, die sie aus dem extrazellulären Raum aufgenommen haben. GCET2 war zuvor als solider genetischer Marker für kreuzpräsentierende dendritische Zelle von unserem Labor identifiziert worden. Ich habe zwei transgene Maus-Lilien charakterisiert, in denen der menschliche Diphtherie-Toxin-Rezeptor unter der Kontrolle des GCET2-Promotors exprimiert wird. Die Zellen, die den Diphtherie-Toxin-Rezeptor exprimieren, können durch die Gabe von Diphtherie-Toxin gezielt getötet und dadurch aus der lebenden Maus entfernt werden. Dies ermöglicht die Untersuchung der Funktion dieser Zellen. Ich konnte zeigen, dass GCET2-positive dendritische Zellen über die Oberflächen-Marker CD11c, CD8α und XCR1 verfügen, aber nicht über die Oberflächen-Marker CD4, CD11b und SIRPα. Die Entfernung der GCET2-positiven dendritischen Zellen blockiert den Prozess der Kreuzpräsentation und zeigt dadurch, dass GCET2-positive dendritische Zellen essentiell für die Kreuzpräsentation sind. Beim Vergleich von GCET2-positiven dendritischen Zellen und XCR1-positiven dendritischen Zellen, die bereits als kreuzpräsentierende dendritische Zellen etabliert waren, zeigte sich, dass es zwischen beiden Zell-Populationen keinen Unterschied hinsichtlich Funktion, Lokalisierung und Gen-Expression gibt. Eine eindeutigere Beschreibung der Population der kreuzpräsentierenden dendritischen Zellen kann uns in der Entwicklung neuer Impfungen zur Prävention und Behandlung von Infektionen und Krebserkrankungen unterstützen.