Optimierung und Charakterisierung eines hochauflösenden Lichtscheibenmikroskops für geklärte Proben

Abstract

Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein Lichtscheibenmikroskop für die Messung von großen Proben entwickelt. Bei der Lichtscheibenmikroskopie wird nur eine dünne Schicht in der Probe beleuchtet. Diese selektive Beleuchtung erlaubt eine geringe Belastung der Probe, während der Aufnahme, durch das Beleuchtungslicht. Die Lichtscheibenmikroskopie ist prädestiniert für Messungen von großen Proben, da eine ganze Ebene auf einmal beleuchtet wird. Große Proben, wie z. B. ganze Maushirne, können in wenigen Stunden mikroskopiert werden. Außerdem führt diese Beleuchtungsart zu einer guten axialen Auflösung. <br /> Die Lichtscheibenmikroskopie erlaubt in Kombination mit ausgefeilten Klärtechniken die optische Bildgebung von ganzen Maushirnen. Durch das Klären der Maushirne ist es möglich, mit Hilfe von fluoreszierenden Farbstoffen, neuronale Verbindungen in einem ganzen Maushirn sichtbar zu machen. In vielen neurologischen Fragestellungen spielen Verknüpfungen innerhalb eines Gehirns eine Rolle. Durch die Erzeugung von optischen Schnitten ist ein mechanisches Zerschneiden des Gehirns in einzelne Scheiben für viele Fragestellungen nicht mehr notwendig. <br /> Hierbei ist es wichtig, dass das Mikroskop zuverlässig und stabil läuft. Auch soll auf die Benutzerfreundlichkeit geachtet werden. Es wird in dieser Arbeit ausführlich auf den generellen Aufbau des Mikroskops und die verwendeten Komponenten eingegangen. Die Proben befinden sich in einer organischen Lösung mit einem hohen Brechungsindex. Abbildungsfehler können bei optischen Aufbauten einen maßgeblichen Effekt auf die Abbildungsqualität haben. Deshalb wird in der Dissertation auf sphärische Aberrationen genauer eingegangen und erläutert, wie diese für eine einfache Grenzfläche berechnet werden können. Diese Art von Aberrationen können einen maßgeblichen Effekt auf das Auflösungsvermögen eines Mikroskops haben. <br /> Wie bei anderen optischen Mikroskopietechniken kann es zu einer Defokussierung und damit zu einer Verschlechterung der Bildqualität kommen. Um die auftretende Defokussierung zu korrigieren, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Fokusstabilisierung entwickelt. Diese dient dazu, dass eine stabile Messung über einen langen Zeitraum möglich ist. Die Fokusstabilisierung wurde unter verschiedenen Bedingungen getestet und charakterisiert.<br /> Mit der Software Zemax wurden die optischen Eigenschaften des Mikroskops simuliert und mit analytischen Berechnungen verglichen.<br /> Wie jeder optische Aufbau muss auch dieser zunächst gründlich charakterisiert werden. Für die Charakterisierung wurde ein Phantom aus Epoxidharz und fluoreszierenden Mikropartikeln entwickelt. Mit diesem Phantom ist es möglich, die Auflösung des Mikroskops<br /> zu bestimmen. <br /> Schließlich wird auf die Messung von ganzen Maushirnen eingegangen. Hierzu wurde ein Gehirn mit einem Transplantat aus neuronalen Stammzellen (lt-NES Zellen) verwendet. Es wurde ein Transplantationsgehirn gewählt, da Transplantationsgehirne einen erheblichen Anteil der Proben darstellen, die mit dem Mikroskop untersucht werden. Die Behandlung mit humanen Stammzellen könnte Patienten mit neurologischen Erkrankungen, wie der Parkinson-Krankheit oder der Huntington-Krankheit, helfen. Am Ende der Dissertation werden noch einzelne Aspekte diskutiert. Es wird darauf eingegangen, welche Beleuchtungsarten es neben einem Gauß-Strahl noch gibt, bzw. ob die Bildqualität durch adaptive Optik weiter verbessert werden kann.