Simultaneous identification of nucleotide-modified aptamers with different properties by multiplexed click-SELEX

Abstract

Voltage-gated sodium channels (VGSC) are important key regulators in excitable tissue that initiate and propagate the action potential in specifically excitable tissue such as brain nerves or muscle. In order to understand the impact of VGSC on the complex nerve system, specific molecular tools are required that enable the spatial-temporal control of VGSC function. These tools shall recognize and modulate VGSC with high affinity and utmost specificity.<br /> Aptamers are short oligo(deoxy)nucleotides that are able to interact with target molecules in a highly affine and specific way. Aptamers are identified by an in vitro selection procedure known as SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment).<br /> The present study investigated whether the SELEX methods allow the generation of aptamers targeting voltage-gated sodium channels. Several selection methods such as cell-SELEX, click-SELEX, or SELEX targeting small peptides were investigated using the different subtypes of VGSC (Nav1.1, Nav1.2, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6). All selections led to an enrichment of aptamers targeting the VGSC-presenting HEK293 cells or the peptide immobilization matrix, but not VGSC or VGSC-peptides. One possible cause might be the limited chemical diversity in the subjected library. Click-SELEX, which uses copper(I)-catalyzed alkyne–azide cycloaddition (CuAAC) for DNA functionalization, promises a higher chemical diversity in the library compared to DNA libraries, but allows only one modification per library. The present study established a multiplexed click-SELEX approach. This unique method allows the selection of clickmers from several libraries containing different modifications in one procedure, e.g., by using five different azides for DNA functionalization.<br /> The multiplexed click-SELEX method has been validated in two selections targeting two different proteins, Cycle 3 Green Fluorescent Protein (C3-GFP) and streptavidin. Both selections led to the generation of highly affine and specific clickmers with slow dissociation (koff rate). The clickmers depend on the correct functionalization for interaction with the protein.<br /> Now that multiplexing of modified nucleobases has been established in a SELEX, the procedure in this proof of concept study can be applied to a variety of other targets. The simple applicability of the multiplexed click-SELEX approach will benefit all in vitro selection methods and allow the generation of clickmers targeting “difficult” target molecules such as VGSC.

Spannungsgesteuerte Natriumkanäle (VGSC) sind wichtige Schlüsselregulatoren im erregbaren Gewebe, die das Aktionspotenzial in spezifisch erregtem Gewebe wie Hirnnerven oder Muskeln initiieren und propagieren. Um die Auswirkungen von VGSC auf das komplexe Nervensystem zu verstehen, sind spezifische molekulare Werkzeuge erforderlich, die eine räumlich-zeitliche Kontrolle der VGSC-Funktion ermöglichen. Diese Werkzeuge sollen VGSC mit hoher Affinität und höchster Spezifität erkennen und modulieren.<br /> Aptamere sind kurze Oligo(desoxy)nucleotide, die in der Lage sind, mit Zielmolekülen auf hochaffine und spezifische Weise zu interagieren. Aptamere werden durch ein in vitro Selektionsverfahren namens SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) identifiziert.<br /> Die vorliegende Studie untersuchte, ob die SELEX-Methoden die Erzeugung von Aptameren ermöglichen, die auf spannungsgesteuerte Natriumkanäle abzielen. Mehrere Selektionsmethoden wie cell-SELEX, click-SELEX oder SELEX, die auf kleine Peptide abzielen, wurden mit den verschiedenen Subtypen von VGSC (Nav1.1, Nav1.2, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6) untersucht. Alle Selektionen führten zu einer Anreicherung von Aptameren, die auf die VGSC-präsentierenden HEK293-Zellen oder die Peptidimmobilisierungsmatrix abzielen, aber nicht auf VGSC oder VGSC-Peptide. Eine mögliche Ursache könnte die begrenzte chemische Vielfalt in der untersuchten Bibliothek sein. Click-SELEX, die die kupfer(I)-katalysierte Alkinazid-Cycloaddition (CuAAC) zur DNA-Funktionalisierung einsetzt, verspricht eine höhere chemische Vielfalt in der Bibliothek im Vergleich zu DNA-Bibliotheken, erlaubt aber nur eine Modifikation pro Bibliothek. Die vorliegende Studie etablierte einen multiplexten click-SELEX-Ansatz. Diese einzigartige Methode ermöglicht die Selektion von Clickmeren aus mehreren Bibliotheken mit unterschiedlichen Modifikationen in einem Verfahren, z.B. durch die Verwendung von fünf verschiedenen Aziden zur DNA-Funktionalisierung.<br /> Die multiplexierte click-SELEX-Methode wurde in zwei Selektionen validiert, die auf zwei verschiedene Proteine abzielen, Cycle 3 Green Fluorescent Protein (C3-GFP) und Streptavidin. Beide Selektionen führten zur Erzeugung von hochaffinen und spezifischen Clickmeren mit langsamer Dissoziation (koff rate). Die Clickmere zeigten eine kritische Abhängigkeit von der korrekten Funktionalisierung für die Interaktion mit dem Protein.<br /> Nachdem das Multiplexing von modifizierten Nukleobasen in einem SELEX etabliert wurde, kann das Verfahren dieser Konzeptbeweis-Studie auf eine Vielzahl anderer Ziele angewendet werden. Die einfache Anwendbarkeit des multiplexen click-SELEX-Ansatzes wird allen In-vitro-Selektionsmethoden zugutekommen und die Erzeugung von Clickmeren ermöglichen, die auf "schwierige" Zielmoleküle wie VGSC abzielen.