Jaworek, Witold: Analyse der Thermostabilität mitochondrialer Proteine anhand der Protein-Disaggregation durch Hsp78 in Bäckerhefe. - Bonn, 2021. - Dissertation, Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn.
Online-Ausgabe in bonndoc: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5-61229
@phdthesis{handle:20.500.11811/8918,
urn: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:hbz:5-61229,
author = {{Witold Jaworek}},
title = {Analyse der Thermostabilität mitochondrialer Proteine anhand der Protein-Disaggregation durch Hsp78 in Bäckerhefe},
school = {Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn},
year = 2021,
month = feb,

note = {Alle Organismen zeichnen sich durch spezifische auf ihre Lebensbedingungen angepasste Charakteristika aus. Hefen, darunter auch die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, besitzt eine Vielzahl an spezialisierten Proteinen, welche ihnen das Leben unter den gegebenen Bedingungen ermöglichen. Ein wesentlicher Faktor dabei ist die Erhaltung der Proteinhomöostase. Bei der Untersuchung von Hitzeschockproteinen ist das in Mitochondrien vorkommende Hitzeschockprotein 78 (Hsp78), welches der Hitzeschockprotein 100 (Hsp100) Familie angehört, als eine Art mitochondrialer Sonderfall identifiziert worden.
Dieses besitzt im Gegensatz zu anderen Proteinen keinen Homolog in humanen Organismen. Die Untersuchung dieses Proteins, seiner Bedeutung und Funktion sind deshalb von speziellem Interesse, um mögliche unbekannte Protein-protektive Mechanismen in Mitochondrien zu identifizieren. Grundsätzlich ist bekannt, dass Hsp78 in der Lage ist unter Hitzeeinfluss aggregierte Proteine wieder aufzulösen, um deren Abbau oder eine Rückfaltung in ihre funktionelle Form zu begünstigen. Hierbei wurden bereits einige Substrate identifiziert, jedoch noch keine Hsp78-basierte Proteomstudie in Mitochondrien durchgeführt.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es herauszufinden, welche mitochondrialen Proteine grundsätzlich eine Thermosensitivtät aufzeigen und welche mitochondrialen Funktionen und die damit verbundenen Proteine von einer Bindung an das Hsp78-Chaperon beeinflusst werden? Hierbei sollten weitere Hsp78-Substrate identifiziert und der intramitochondriale Einfluss des Chaperons definiert werden. Experimentell wird dabei in Anlehnung an andere Hsp100 Substratstudien auf eine Mutante mit defizienter ATPase-Funktion zurückgegriffen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde diese neue Hsp78-Mutante als hsp78TR bezeichnet und zuerst im Vergleich mit dem Wildtyp charakterisiert. Hierbei zeigte sich für die Mutante ein ATPase-Aktivitätsverlust mit veränderten Komplexbildungs- und Substratbindungseigenschaften. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde diese in Experimenten mit stabiler Isotopenmarkierung von Aminosäuren in Zellkultur (engl.: stable isotope labeling of amino acids in cell culture (SILAC)) für die Koaufreinigung mit anschließender massenspektrometrischer (MS) Analyse eingesetzt. Des Weiteren wurden in einem in organello Aufbau, thermo-sensitive mitochondriale Proteine und mögliche Hsp78-Substrate über eine aktive Auflösung hitzeinduzierter Aggregate bestimmt. Abschließend wurden beide MS-Datensätze bioinformatisch zusammengeführt und ein deutlicher Einfluss des Hsp78-Chaperons auf eine Vielzahl wichtiger mitochondrialer Funktionen aufgezeigt. Besonders auffallend war die Aggregation von Proteinen, welche Bindungsreaktionen vermitteln. Darüber hinaus zeigt das mitochondriale Proteom eine starke Beeinträchtigung durch Hitzestress bei der mitochondrialen Translation. In diesem Zusammenhang scheint Hsp78 ein zentraler Faktor bei der Reaktivierung translationaler Komponenten zu sein und darüber hinaus auch andere Funktionen wie die Energieproduktion und den Aminosäuremetabolismus stark zu beeinflussen. Die gewonnen Informationen könnten zukünftig dafür genutzt werden, das Aggreationsverhalten von anderen Proteinen zu erforschen oder um die Kapazität bzw. Effizienz von anderen Disaggregasen zu beeinflussen.
Bei der Untersuchung der Rolle von Hsp78 in der Reaktivierung von mitochondrialen Komponenten nach Hitzestress wurde Ssc1 als wichtiges Substrat bestätigt. Gleichzeitig wird vermutet, dass das Hsp70 Chaperon auch als funktioneller Interaktionspartner bei der Stimulation der ATPase-Aktivität von Hsp78 fungiert, während es grundsätzlich als wichtige Komponente der Importmaschinerie Membran-gebunden arbeitet. Um die hohe funktionelle Diversität von Ssc1 zu beleuchten wurden potentielle posttranslationale Modifikationen des Proteins mittels verschiedener experimenteller Ansätze untersucht.},

url = {http://hdl.handle.net/20.500.11811/8918}
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