Optimierung und Charakterisierung eines Zwei-Photonen-Besselstrahl-Lichtscheibenmikroskops

Abstract

In dieser Arbeit wurde ein existierendes konfokales Zwei-Photonen-Lichtscheibenmikroskop charakterisiert und modifiziert. Das System wurde sowohl für Aufnahmen bei hohen Geschwindigkeiten als auch für Langzeitaufnahmen optimiert. Das Mikroskop wurde ursprünglich von Eugen Baumgart für die Untersuchung lebender Zebrafischlarven entworfen und gebaut. <br /> Die im ursprünglichen Aufbau verwendete Gaußbeleuchtung wurde durch eine zusätzliche Besselbeleuchtung ergänzt, wodurch sich das nutzbare Sichtfeld um den Faktor 4 erhöhte und die axiale Auflösung verbesserte. <br /> Durch die Kombination von Lichtscheibenmikroskopie und konfokaler Detektion mit einem <em>Rolling Shutter</em>, konnte der Bildkontrast bei Zwei-Photonen-Absorption gesteigert werden. Für die einfache Kalibrierung des Mikroskops wurde ein Strahlanalyseprogrammes entwickelt, mit welchem die Lage und Verkippung des Laserstrahls in der Probe bestimmt werden kann. <br /> Durch die Erweiterung des Aufbaus um eine zweite Detektionskamera und eine zweite Laserlinie können zwei Farbkanäle gleichzeitig aufgenommen werden. <br /> Bei hohen Aufnahmeraten zeigte sich eine Desynchronisation zwischen Anregungslaser und <em>Rolling Shutter</em>, welche als Funktion der Scanfrequenz gemessen und durch frequenzabhängige Korrekturen aufgehoben wurde. <br /> Bei einer dreidimensionalen Aufnahme wurde eine Aufnahmerate von 3,5 Hz bei konfokaler Detektion erreicht. Damit konnte stimulierte Neuronenaktivität im optischen Tektum fünf Tage alter Zebrafischlarven beobachtet werden. <br /> Um die Probe fixiert im Sichtfeld der Kamera zu halten, wurde eine automatische Korrektur der Probenbewegung in allen Raumrichtungen entwickelt. Diese basiert auf der Messung der Bildverschiebung der Maximumintensitätsprojektionen entlang der drei Raumrichtungen. <br /> Im Verlauf von Langzeitmessungen kam es sowohl zu einer Defokussierung in Detektionsrichtung (Z-Defokus), wie auch zu einem Verlust der Synchronisation zwischen Laser und Detektor (Y-Defokus). Daher wurden zwei automatische Fokussysteme entwickelt, um beide Effekte zu kompensieren. Hierbei wurden drei neuartige Fokusmetriken entwickelt und mit bekannten Metriken verglichen. Eine besondere Herausforderung bei der Fokussierung stellte Rauschen dar, welches durch verschiedene Vorbehandlungsschritte reduziert werden konnte. Insgesamt hat sich die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Metrik der kombinierten FFT mit Hochpassfilter als die Beste für das verwendete Mikroskop erwiesen. <br /> Für die Autofokussierung in Y-Richtung wurde eine völlig neue Methode entwickelt. Diese erlaubt erstmalig die Kontraststeigerung durch konfokale Detektion bei Langzeitaufnahmen, ohne einen Verlust des Bildsignals, durch eine Desynchronisierung zwischen Anregungslaser und Detektor, zu riskieren. Bei der Y-Folussierung wird ein kleiner Bereich der Probe mit dem Anregungslaser durchfahren und aus virtuellen Detektoren werden Bilder rekonstruiert, welche sich aufgrund ihres Abstandes zur Strahlmitte in ihrer Helligkeit und ihrem Fokuswert unterscheiden. <br /> Aus den Einzelbildern der Autofokussierungen konnte zudem die Verkippung der Lichtscheibe entlang von drei Raumwinkeln gemessen werden. Dies ermöglicht eine automatische Korrektur der Verkippungen. Bei der Winkelmessung wurde ausgenutzt, dass einige der untersuchten Fokusmetriken den Bildfokus zeilen- bzw. spaltenweise berechnen und anschließend aufsummieren. Indem diese Werte vor der Summierung separat gespeichert werden, bleibt die Information über die Verkippung der Lichtscheibe erhalten.