Die biologische Funktion der N1-2´O-Methylierung eukaryotischer mRNA durch die Methyltransferase CMTr1

Abstract

Eukaryoten modifizieren das 5´-Ende ihrer mRNA mit einem invertierten N7-methyliertem Guanosin (m7G). Diese Cap0 genannte Struktur wird in höheren Eukaryoten durch die Methyltransferase CMTr1 weiter modifiziert: CMTr1 methyliert die 2´O-Position der Ribose des ersten Nukleotides (N1) der mRNA und generiert so die sogenannte Cap1-Struktur.<br /> Während die m7G-Methylierung (Cap0) essentiell für die Funktion der mRNA ist, ist die Bedeutung der zusätzlichen N1-2´O-Methylierung (Cap1) weniger gut definiert. Eine N1-2´O-Methylierung viraler RNA verhindert die Erkennung durch den antiviralen, Typ-I-IFN induzierenden zytosolischen RNA-Rezeptor RIG-I und durch das Typ-I-IFN induzierte Cap0-RNA-bindende antivirale Effektorprotein IFIT1, das die Translation von gebundener Cap0-mRNA inhibiert. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob die Cap1-Struktur als molekulare Selbst-Signatur die endogene mRNA vor Erkennung durch RIG-I und IFIT1 schützt und ob sie noch weitere Funktionen hat.<br /> Dazu wurden in dieser Arbeit CMTr1-Knockout-Zelllinien (CMTr1-KO) generiert und charakterisiert. In CMTr1-KO-Zellen verursachte eine Typ-I-IFN-Behandlung, die zur Aufregulation von IFIT1 führt, eine Reduktion der Viabilität sowie eine globale Translationsinhibition. Dieser Typ-I-IFN-vermittelte Phänotyp konnte in CMTr1-KO-Zellen durch einen zusätzlichen Knockout des IFIT1-Gens komplett unterdrückt werden. Unbehandelte CMTr1-KO-Zellen zeigten eine dauerhafte, leichte Aktivierung des antiviral wirkenden RIG-I-Signalweges durch endogene RNA. Eine Stimulation mit exogenen RIG-I-Liganden in CMTr1-KO-Zellen aktivierte unvermindert den RIG-I-Signalweg. Die Inhibition der Translation von endogener Cap0-mRNA durch IFIT1 führte jedoch zu stark verringerter Typ-I-IFN-Proteinexpression nach RIG-I-Stimulation. Dies bedeutet, dass ein Verlust von Cap1 (N1-2´O-Methylierung) zu einer stark reduzierten Funktionalität der antiviralen Immunantwort führt.<br /> Des Weiteren zeigten die CMTr1-KO-Zellen in Abwesenheit von Typ-I-IFN einen IFIT1-unabhängigen, zellphysiologisch komplexen Phänotyp. CMTr1-KO-Zellen hatten eine verringerte Zellgröße und proliferierten langsamer. Während keine globalen Effekte von CMTr1 auf die Transkriptstabilität und die Effizienz der Spleißreaktion festgestellt wurden, zeigten sich in CMTr1-KO-Zellen auf Transkriptionsebene eine reduzierte Expression von Komponenten der Translationsmaschinerie. Dieser CMTr1-abhängige Effekt war besonders auffällig bei für ribosomale Proteine (RP) kodierender mRNA, geht aber darüber hinaus und betrifft Transkripte, die das konservierte 5´terminale Oligopryrimidin Motiv (5´TOP) aufweisen und/oder snoRNA Host Genes (SNHGs) sind.<br /> Darüber hinaus konnte ein hochspezifisches, CMTr1-abhängiges alternatives Spleiß-Event von NVL2 identifiziert werden. NVL2 wurde als essentieller Faktor der Ribosomenbiogenese beschrieben. In Abwesenheit von CMTr1 wurde die NVL2-prä-mRNA durch ein bisher nicht beschriebenes Exonskipping-Event des achten Exons alternativ gespleißt, was zur Bildung einer nicht funktionalen Isoform führte. Dadurch ist die Proteinexpression von NVL2 in CMTr1-KO-Zellen um bis zu 88 % reduziert. Dieser Phänotyp konnte durch die Überexpression von wildtyp-CMTr1 kompensiert werden, nicht aber durch eine Methyltransferase-defiziente CMTr1-Mutante. Dies legt die N1-2’O-Methylierung als Voraussetzung für korrektes Spleißen von NVL2 nahe. Trotz starker Reduktion der NVL2-Expression konnte keine Beeinträchtigung der rRNA-Prozessierung festgestellt werden.<br /> Zusammengenommen lässt sich der durch den Verlust von CMTr1 ausgelöste Phänotyp als reduzierte Kapazität der Translations- und Ribosomenbiogenese-Maschinerie der Zellen beziehungsweise als Kompensation der Zellen auf diese Effekte deuten. Während diese Arbeit bisher noch nicht beschriebene, weitreichende Effekte der CMTr1-vermittelten Cap1-Generierung auf die Zellphysiologie nachweist, bedürfen die zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen weitergehender Erforschung.