Etablierung und Optimierung eines Produktionssystems zur Synthese des alternativen Süßstoffs 5-Ketofruktose in <em>Gluconobacter</em>-Stämmen

Abstract

Übergewicht, Adipositas und Diabetes sind in der heutigen Gesellschaft längst keine seltenen Krankheiten mehr. In den letzten Jahrzehnten hat die Prävalenz dieser Erkrankungen enorm zugenommen und kann mit einer zuckerreichen und hoch-kalorischen Ernährungsweise in Verbindung gebracht werden. Einer der Hauptgründe für die Aufnahme unverhältnismäßig hoher Mengen an Zuckern stellt der massive Zusatz von Saccharose, Fruktose und Glukose in Konsumgütern dar. Um diesen Problemen entgegenzuwirken, finden vermehrt alternative Süßungsmittel einen Einsatz in der Lebensmittelindustrie. Die vorliegende Arbeit befasste sich daher mit der Entwicklung eines Verfahrens zur Produktion des Zuckerersatzstoffs 5-Ketofruktose (5-KF). Dieses Fruktosederivat stellt aufgrund seiner sensorischen Eigenschaften und seines Nährwerts eine vielversprechende Möglichkeit zum Austausch kalorienreicher Zucker in Lebensmitteln dar. <br /> Die Herstellung von 5-KF aus Fruktose erfolgte in dieser Arbeit mit Hilfe bakterieller Expressionssysteme durch die heterologe Produktion der membrangebundenen Fruktose-Dehydrogenase (FDH) in <em>Gluconobacter oxydans</em>. Durch gezielte Genom-Modifikationen und einer doppelten chromosomalen Integrationen des <em>fdh</em>-Operons in <em>G. oxydans Δmgdh::fdh Δsgdh::fdh</em> konnte ein industrielles Produktionsverfahren etabliert werden, das zukünftig eine antibiotikafreie Synthese von 5-KF aus Fruktose ermöglicht. <br /> Um ein industriell angepasstes Verfahren zur Synthese von 5-KF auch aus dem alternativen und kostengünstigen Substrat Saccharose zu ermöglichen, wurde in der vorliegenden Arbeit ein Gluconobacter-basiertes Ein-Stamm-System entwickelt. Zur Substraterweiterung war als initialer und notwendiger Schritt eine effiziente Saccharosespaltung erforderlich. Dafür konnte im Rahmen dieser Arbeit eine Invertase aus <em>G. japonicus</em> LMG 1417 (Inv1417) identifiziert werden, die die höchste spezifische Aktivität unter allen bisher beschriebenen Invertasen im mesophilen Temperaturbereich aufwies (V_max = 2295 ± 243 U/mg Protein). Durch chromosomale Integration des <em>fdh</em>-Operons und Plasmid-vermittelte Produktion der Invertase1417 in <em>G. oxydans Δmgdh::fdh inv</em> konnte das erste Ein-Stamm-System generiert werden, welches eine biotechnologische Herstellung des alternativen Süßstoffs 5-KF aus Saccharose mit Ausbeuten von 84 ± 2 % ermöglicht. <br /> Durch den Nachweis eines homologen Enzyms zu Inv1417 und einem chromosomal integrierten fdh-Operon im Wildtyp-Stamm G. japonicus LMG 26773 konnte ein weiteres Ein-Stamm-System zur Produktion von 5-KF aus Saccharose identifiziert werden. Als Nebenprodukt des Herstellprozesses mit <em>G. japonicus</em> LMG 26773 wurde zudem das Präbiotikum Levan nachgewiesen. Als unveränderter Wildtyp stellt <em>G. japonicus</em> LMG 26773 somit eine vielversprechende Möglichkeit für einen Einsatz im Lebensmittelbereich dar. Der Stamm ermöglicht die erste Gentechnik-freie Umwandlung der kalorienreichen Zucker Saccharose und Fruktose zu 5-KF und zusätzlich die Synthese des kostspieligen Präbiotikums Levan.