Histidine and Tyrosine-based Heme-binding Motifs for the Prediction of Heme-Regulated Proteins

Abstract

The versatile molecule heme (iron protoporphyrin IX) fulfils numerous vital functions as a part of hemoproteins, such as hemoglobin and cytochromes, in which it is essential for oxygen transport, electron transport, and detoxification. Under certain conditions, it can be released from hemoproteins and then regulate cellular processes, but also exert toxic effects. In recent years, significant progress has been made towards the understanding of this regulatory heme. Surface-exposed sequence stretches were found to play a crucial role and with the cysteine-proline dipeptide, the first heme-regulatory motif (HRM) was identified. Histidine and tyrosine were also frequently identified in heme-regulated proteins and heme-binding peptides, but a distinct histidine/tyrosine (H/Y)-based motif has not been discovered yet. <br /> In this thesis, H/Y-based motifs were analyzed systematically. For this purpose, four subclasses of heme-binding peptides (A-D) were established from all possible combinations of histidine and tyrosine, and divided according to spacer length (0-3 amino acids). Over 50 model peptides were synthesized and analyzed in depth by ultraviolet-visible (UV/Vis), resonance Raman, and NMR spectroscopy. It was found that motifs with spacer lengths of 1 (subclass B) and 3 (subclass D) exhibited the strongest heme-binding affinities and most binders were found in these classes. Structural studies revealed that these classes occupy mixed conformational states of penta- and hexacoordination and two NMR structures were solved. Overall, the motifs HXH, HXXXY, and HXXXH were found to be the most promising H/Y-based heme-binding motifs. These findings were combined with those of earlier studies and implemented into a web application called HeMoQuest. This tool allows users to predict HRMs from protein sequence and features a machine learning algorithm, which was trained with experimental peptide data. As an example of H/Y-based motifs, two proteins were studied herein. The first protein is Janus kinase 2 (JAK2), which is critical in nascent erythrocytes to propagate growth signals and increase hemoglobin production. Heme was confirmed to activate JAK2 and its corresponding downstream signaling in the K562 cell line. Furthermore, a YXH and a cysteine-proline (CP) motif were suggested as heme-binding sites in the catalytically active Janus homology 1 (JH1) domain. The second protein, Toll-like receptor 4 (TLR4), was found to be connected to three major heme-related pathologies, i.e. inflammation, thrombosis, and hemolysis. A systematic <em>in silico</em> analysis of heme binding to TLR4 was therefore performed with the aid of HeMoQuest and docking experiments. Therein, a suitable HXXXY motif on TLR4 itself and an interesting interaction with the lipopolysaccharide binding pocket was predicted. <br /> The results presented in this thesis show distinct H/Y-based HRMs on the peptide level, which are used to successfully predict protein candidates. The combined knowledge is made available to the scientific community through a web-based algorithm. Better understanding of regulatory heme binding and heme biology may allow for targeted treatment and prevention of heme-related diseases.

<strong>Histidin- und Tyrosin-basierte Hämbindemotive zur Vorhersage von Häm-regulierten Proteinen</strong><br />Das vielseitige Molekül Häm (Eisenprotoporphyrin IX) erfüllt lebenswichtige Funktionen als Bestandteil zahlreicher Hämoproteine, wie z. B. Hämoglobin und Cytochrome, in denen es unerlässlich für Sauerstofftransport, Elektronentransport und Detoxifikation ist. Unter bestimmten Bedingungen kann es aus Hämoproteinen freigesetzt werden und dann zelluläre Prozesse regulieren, aber auch selbst toxische Wirkungen ausüben. In den letzten Jahren wurden bedeutende Fortschritte hinsichtlich des Verständnisses von diesem regulatorischen Häm gemacht. Man fand heraus, dass oberflächenexponierte Sequenzabschnitte eine entscheidende Rolle spielen und identifizierte mit dem Cystein-Prolin-(CP-)Dipeptid das erste Häm-regulatorische Motiv (HRM). Auch Kombinationen von Histidin und Tyrosin wurden häufig in Häm-regulierten Proteinen und Häm-bindenden Peptiden identifiziert, aber ein eindeutiges Histidin/Tyrosin (H/Y)-basiertes Motiv wurde bisher noch nicht vorgestellt. <br /> In dieser Arbeit wurden H/Y-basierte Motive systematisch analysiert. Dazu wurden aus allen theoretisch möglichen Kombinationen von Histidin und Tyrosin vier Unterklassen von Häm-bindenden Peptiden (A-D) gebildet und entsprechend der Anzahl an „Spacer“-Aminosäuren (0-3) zwischen den koordinierenden Resten unterteilt. Über 50 Modellpeptide wurden synthetisiert und mittels UV/Vis-, Resonanz-Raman- und NMR-Spektroskopie eingehend analysiert. Es zeigte sich, dass Motive mit Spacerlängen von 1 (Unterklasse B) und 3 (Unterklasse D) die stärksten Häm-Bindungsaffinitäten aufwiesen und auch insgesamt die meisten bindenden Peptide enthielten. Strukturelle Untersuchungen zeigten, dass diese Klassen gemischte Konformationszustände aus Penta- und Hexakoordination einnehmen können und zwei NMR-Strukturen wurden gelöst. Insgesamt erwiesen sich die Motive HXH, HXXXY und HXXXH als die vielversprechendsten H/Y-basierten Motive. Diese Ergebnisse wurden mit denen früherer Studien kombiniert und zu einer Webanwendung namens HeMoQuest zusammengefügt. Der dieser Anwendung zugrundeliegende Algorithmus ermöglicht es Benutzern, HRMs mittels maschinellem Lernen aus einer gegebenen Proteinsequenz vorherzusagen. Als Beispiel für H/Y-basierte Motive wurden in dieser Arbeit zwei Proteine intensiver untersucht. Das erste Protein ist die Janus-Kinase 2 (JAK2), die in Präerythrozyten entscheidend für die Weiterleitung von Wachstumssignalen und die Steigerung der Hämoglobinproduktion ist. Es wurde bestätigt, dass Häm in der K562-Zelllinie JAK2 und nachgeschaltete Signale aktiviert. Ein YXH- und ein CP-Motiv wurden als Häm-Bindungsstellen in der katalytisch aktiven Janus homology 1 (JH1)-Domäne vorgeschlagen. Das zweite Protein, der Toll-like Rezeptor 4 (TLR4), wurde bereits mit drei zentralen Häm-bezogenen Pathologien in Verbindung gebracht: Entzündung, Thrombose und Hämolyse. Daher wurde eine systematische <em>in silico</em> Analyse der Häm-Bindung an TLR4 mit Hilfe von HeMoQuest und Docking-Experimenten durchgeführt. Dabei wurde ein HXXXY-Motiv auf TLR4 selbst und eine Interaktion mit der Lipopolysaccharid-Bindungstasche vorhergesagt. <br /> Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse zeigen eindeutige H/Y-basierte HRMs auf Peptidebene, die zur erfolgreichen Vorhersage von Proteinkandidaten genutzt werden können. Die kombinierten Erkenntnisse werden der Öffentlichkeit durch einen webbasierten Algorithmus zur Verfügung gestellt. Ein besseres Verständnis der regulatorischen Häm-Bindung und der Häm-Biologie könnte eine gezielte Behandlung und Vorbeugung von Häm-bezogenen Krankheiten ermöglichen.