G protein coupled receptors require active Gαq to mobilize Gi-Gβγ-dependent calcium

Abstract

The mechanisms by which GPCRs drive calcium mobilization in living cells have been a topic of intense research interest for many years. One such mechanism is the paradigmatic Gi-calcium pathway, which describes how Gβγ subunits released from heterotrimeric Gi proteins upon stimulation of a Gi-coupled GPCR can bind and activate PLCβ2 and PLCβ3. These enzymes of the PLCβ family then hydrolyze PIP₂ into DAG, which regulates a number of cellular effectors, and IP₃, which triggers the release of calcium from the cellular stores via IP₃-sensitive ion channels. <br /> Despite the apparent clarity of this well-described Gi-Gβγ-PLCβ-calcium pathway, Gi-GPCR calcium is highly variable across cell types, and difficult to generate under most circumstances. Intriguingly, although Gi-Gβγ-PLCβ-calcium is widely accepted as a ‘stand-alone’ independent signaling module, a number of studies indicate that the canonical Gq-GPCR pathway, which also activates PLCβ to trigger calcium release, might affect or even control Gi-Gβγ-PLCβ-calcium. <br /> Here we investigate a possible dependency of Gi-Gβγ-PLCβ-calcium on the Gq pathway, with the goal of determining why Gi-Gβγ-PLCβ-calcium is variable and difficult to generate. Using a set of recently discovered, cutting edge tools including CRISPR/Cas9-edited cell lines lacking Gαq expression and the Gq inhibitor FR, we show that Gi-Gβγ-PLCβ-calcium is fully dependent on, and only occurs in the presence of, active Gαq. We find that other, PLCβ-independent Gi signaling pathways do not share this requirement for active Gαq. While the downstream consequences of Gαq-activation do not suffice to restore Gi-Gβγ-PLCβ-calcium, removal of the auto-inhibitory domains of PLCβ enables activation by Gi-Gβγ that suffices to mobilize calcium without Gαq. Based on this, we argue that Gαq controls Gi-Gβγ-PLCβ-calcium by relieving the auto-inhibition of PLCβ. It thereby allows sufficient activation by Gi-Gβγ to achieve the acute production of IP₃ required for calcium mobilization. Finally, we demonstrate that the necessity of active Gαq for Gi-Gβγ-PLCβ-calcium is conserved across a wide variety of physiologically relevant cell types and influences calcium-dependent cellular functions, such as the aggregation of platelets. Our proposed molecular mechanism provides the missing link to explain the variability of Gi-Gβγ-PLCβ-calcium, and thereby fundamentally contributes to our understanding of how Gi-GPCRs signal.

Mechanismen und Signalwege, die in eukaryotischen Zellen Calcium freisetzen, stellen seit Langem ein Forschungsgebiet von großem Interesse dar. Ein solcher Calcium-Freisetzungsmechanismus ist der Gi-Calcium Signalweg. Er beschreibt, dass bei der Aktivierung von Gi-gekoppelten GPCRs aus heterotrimeren Gi Proteinen freigesetzte Gβγ Untereinheiten an PLCβ2 und PLCβ3 Enzyme binden und diese aktivieren. Die Enzyme der PLCβ Familie hydrolysieren daraufhin PIP₂ aus der Zellmembran zu DAG und IP₃. Durch diese Produktion von IP₃ werden IP3R auf der Membran des ER aktiviert, durch die daraufhin Calcium aus dem ER ins Zytosol strömt. <br /> Obwohl dieser Mechanismus seit langem beschrieben ist und in der Theorie vergleichsweise unkompliziert wirkt, zeigt er sich in der Praxis oftmals unerklärlich variabel und ist in vielen Zellsystemen schwer zu generieren. Viele Studien deuten sogar darauf hin, dass dieser eigentlich als unabhängig akzeptierte Gi-Gβγ-PLCβ-Calcium Signalweg maßgeblich durch Gq-gekoppelte GPCRs reguliert wird, welche über die Freisetzung von Gαq auch die PLCβ aktivieren können. <br /> Daher wird in dieser Studie der Gi-Gβγ-PLCβ-Calcium Signalweg erneut betrachtet, mit dem Ziel, den Grund für seine Variabilität zu identifizieren. Unter Verwendung der neusten Technologie, wie CRISPR/Cas9-editierten HEK Zelllinien und dem spezifischen Gq Protein Inhibitor FR, wird gezeigt, dass Gi-Gβγ-PLCβ-Calcium vollständig von aktivem Gαq abhängig ist und sich daher nur bei Gαq -Aktivierung generieren lässt. Diese Abhängigkeit zeigt sich allein für den Gi-Gβγ-PLCβ-Calcium Signalweg, während andere Gi-Signalwege ohne Gαq Aktivierung ablaufen können. Des Weiteren demonstrieren wir, dass die downstream Konsequenzen der Gq-Signalkaskade nicht ausschlaggebend sind, um Gi-Gβγ-PLCβ-Calcium wiederherzustellen. Dies ist darin begründet, dass Gβγ die PLCβ zwar ohne Gq-Aktivierung binden kann, allerdings kann Gβγ die starke Autoinhibition des PLCβ Enzyms nicht aufheben und somit allein nicht ausreichend PLCβ vermittelte IP₃ Produktion erreichen, um eine Calcium-Freisetzung auszulösen. Dies ändert sich, wenn die autoinhibitorischen Domänen der PLCβ durch Mutation entfernt oder gestört werden, oder wenn aktives Gαq die PLCβ bindet und dadurch in die aktive, nicht-autoinhibierte Konformation überführt. Dieser Mechanismus erklärt die Gαq-Abhängigkeit der Gi GPCR-vermittelten Calciumfreisetzung, welche wir in verschiedensten physiologischen Zellsystemen darstellen. Die vorliegende Studie bietet damit nicht nur eine Erklärung für die Variabilität des paradigmatischen Gi-Gβγ-PLCβ-Calcium Signalwegs, sondern trägt auch maßgeblich zu unserem Grundverständnis der physiologischen Funktionen von Gi- und Gq GPCRs bei.