Generation of an RNA sensor to probe glycolysis in living cells via the key metabolite fructose 1,6-bisphosphate

Abstract

Glycolysis is the cornerstone of cell metabolism and is one of the oldest biochemical pathways known to life. Yet, methods to study glycolysis in single living cells are lacking. The glycolytic intermediate Fructose 1,6-bisphosphate (FBP) generated interest because seminal studies correlated it with glucose influx. Here, a gene-encoded RNA fluorescence sensor was developed for the qualitative assessment of FBP to be used as a metabolic study tool. <br /> For this purpose, the concept of allosteric communication of RNA modules was explored to convert the constitutively fluorogenic RNA Spinach into an FBP-dependent variant. Ad hoc designed libraries were equipped with Spinach?s fluorogenic G-quadruplex core and tested to identify, within the RNA pools, whose sequence space would promote allosteric regulation. To scout FBP-responsive allosteric sequences, the RNA libraries were subjected to selection methodologies based upon SELEX (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment) or on a microfluidic-assisted in vitro compartmentalization pipeline (µIVC). Numerous SELEX trials failed to enrich ligand-induced fluorescence sequences with either FBP or other test molecules, whereas µIVC allowed the identification of sequence 81 (s81), a ratiometric fluorescent sensor for FBP, from a chimeric library design of Spinach with the C45 aptamer, an in vitro selected RNA that binds to FBP. <br /> S81 was characterized in vitro to assess its binding to FBP and DFHBI, the cognate dye of Spinach, and a possible sensing mechanism was laid out on the grounds of the parental chimeric library design. Finally, s81 was transiently expressed in embryonic kidney cells to probe the FBP variation upon oligomycin-induced glycolytic flux increase. Contrary to the literature, FBP was found to decrease upon oligomycin-treatment. Still, the assay provided a window to evaluate the sensor?s performance in the cellular context by demonstrating s81 poly-specificity to phosphate-bearing metabolites. <br /> Nevertheless, the identification of s81 as an FBP-responsive fluorogenic RNA showcased the advantages of combining structurally-guided designs with high-throughput screening pipelines to identify allostery-regulated iterations, which could be straight-forwardly characterized in vitro and tested in cells. This approach is preferable to current design-build-test cycles for RNA sensor discovery, for it allows the screening of entire libraries of millions of different sequences in a non-iterative and holistic manner.

<strong>Erzeugung eines RNA-Sensors zur Untersuchung der Glykolyse in lebenden Zellen über das Schlüsselmetabolit-Fructose-1,6-Bisphosphat</strong><br /> Die Glykolyse ist der Eckpfeiler des Zellstoffwechsels und zugleich einer der ältesten biochemischen Stoffwechselwege. Trotzdem besteht noch immer ein Bedarf an Methoden um die Glykolyse in lebenden Zellen zu untersuchen. Das Stoffwechselzwischenprodukt Fruktose 1,6-bisphosphat (FBP) ist in den letzten Jahren vermehrt in den Fokus der Wissenschaft gerückt, da nachgewiesen werden konnte, dass seine Konzentration mit der Aufnahme von Glukose korreliert. Es ist jedoch unklar, ob diese Korrelation in allen Lebewesen zu finden ist. In dieser Arbeit wurde der Ansatz aufgegriffen einen genetisch-enkodierbaren fluorimetrischen FBP Sensor für die qualitative Analyze von FBP Konzentrationen in lebenden Zellen als Werkzeug für die Stoffwechselforschung zu generieren. <br /> Im Detail wurde dabei versucht mit Hilfe von allosterischen Wechselwirkungen von RNA Modulen die konstitutive fluorogene Eigenschaft des RNA Aptamers "Spinach" in ein FBP abhängiges RNA Sensormodul zu überführen. Dafür wurden Riboswitch-abgeleitete Bibliotheken verwendet, die mit dem fluorogenen G-Quadruplexkern des Spinach Aptamer ausgestattet waren, um diejenigen RNA Spezies zu identifizieren, die eine allosterische Regulation ermöglichen. Die Ermittlung der FBP abhängigen Sequenzen wurde mittels Methoden durchgeführt, die auf SELEX (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment) sowie Mikrofluidikunterstützte in vitro Kompartimentalization (microfluidic-assisted in vitro compartmentalization, µIVC) basierten. Dabei stellte sich heraus, dass die mittels SELEX durchgeführten Versuche nicht erfolgreich waren, jedoch wurde mittels µIVC das Aptamer 81, ein ratiometirsch fluoreszierender Sensor für FBP, identifiziert. Aptamer 81 basiert auf einem chimären Bibliotheksdesign, das das Spinachaptamer mit dem FPB Aptamer C45 verbindet. <br /> Die Bindungseigenschaften von Sequenz 81 (s81) wurden in Bezug auf seinen Liganden FBP sowie dem dazugehörigen Farbstoff DFHBI hin charakterisiert und ein möglicher Mechanismus auf dem zu Grunde liegenden parentalen Bibliotheksdesign wurde erarbeitet. Zuletzt wurde s81 transient in humanen embryonalen Nierenzellen exprimiert um die Änderung der FBP Konzentration zu messen ausgelöst durch oligomycininduzierte Steigerung des Glykolyseflusses. Dabei korrelierte FBP nicht mit der Oligomycinbehandlung. Jedoch bietet dieser Versuch einen Spielraum um die Sensorleistung im zellülären Kontest zu evaluieren durch die Demonstration der Polyspezifität von s81 gegenüber phophatbeinhaltenden Metaboliten. <br /> Nichtsdestotrotz repräsentiert die Identifikation von s81 als ratiometrischer FBP-Sensor die Vorteile der Kombination aus strukturgeleitetem Design und Hochdurchsatzscreening zur Identifikation allosterisch regulierter Iterationen, die dabei direkt in vitro charakterisiert und in Zellen getestet werden können. Dieser Ansatz ist vorrangig geeignet für aktuelle Design-Aufbau-Test Zyklen für RNA-Sensor Entdeckungen, die ein Screening ganzer Bibliotheken von Millionen unterschiedlicher Sequenzen in einem nichtiterativen und ganzheitlichen Art und Weise erlaubt.